Lesson 11 of 20

돌연변이를 세는 규칙

논문 Methods · Mutect2 · COSMIC v102 · 필터 넷

논문 본문에 이런 문장이 있습니다.

엄격한 변이 호출 기준을 써서 IP 에서 515개, SNSCC 에서 702개의
비동의(non-synonymous) COSMIC 등재 체세포 변이를 찾아냈다.

이 한 문장 안에 여섯 개의 결정이 들어 있습니다. 하나씩 풀어 봅시다.

High school돌연변이를 세는 규칙

종양 DNA와 정상 DNA를 비교해 암에서 새로 생긴 변이만 골라냅니다. 이걸 체세포 변이 호출(somatic variant calling)이라고 해요.

이 자리에서	정상	종양	판정
예 1	A/A	A/T	체세포 변이 후보
예 2	A/T	A/T	생식세포 변이 — 제외
예 3	A/A	A/A	변이 없음

정상 조직이 대조군 역할을 합니다 — 짝지은 설계(3강)의 또 다른 이득입니다.

말	뜻	이것 때문에 빠지는 것
체세포(somatic)	태어날 때는 없었고 나중에 생긴 것	타고난 위험 변이 전부
비동의(non-synonymous)	아미노산이 실제로 바뀌는 것	침묵 변이 · 조절부위 변이 · 인트론 변이
COSMIC 등재	암 변이 목록에 이미 있는 것	목록에 없는 새 변이 전부
엄격한 기준	깊이 · 빈도 · 리드 수 문턱	얕게 읽힌 자리, 낮은 빈도 변이
PASS 만	Mutect2 의 자체 필터를 통과한 것	가닥 편향 · 짧은 반복 근처 등
gnomAD 제외	인구집단에 흔한 변이 빼기	드문 생식세포 다형성 일부

세 번째 줄에 표시를 해 두세요. 13강 전체가 그 줄 하나 때문에 생겼습니다.

High schoolMutect2와 필터들

Mutect2는 체세포 변이를 찾는 표준 도구입니다. 그런데 도구가 내놓는 후보를 그대로 쓰면 안 돼요. 인공물이 많이 섞여 있습니다.

필터	거르는 것
읽기 깊이	몇 개만 읽힌 자리 — 판단 불가
정상 조직 대립유전자 수 = 0	정상에도 있으면 생식세포 변이
대립유전자 빈도 문턱	너무 낮으면 FFPE 인공물 의심
COSMIC 등재	암에서 이미 보고된 변이만

네 개의 필터를 다 통과해야 "변이"로 셉니다. 엄격한 기준이에요.

논문이 쓴 네 개의 숫자 문턱

이름	값	뜻
`DepthFilter`	≥ 10	그 자리를 최소 10번은 읽었어야 한다
`tumor VAF`	≥ 0.05	종양 리드의 5% 이상이 변이를 갖고 있어야 한다
`tumor_AlleleCount`	≥ 7	변이를 가진 리드가 최소 7개
`normal_AlleleCount`	= 0	정상 조직에서는 한 개도 나오면 안 된다

마지막 줄이 가장 엄격합니다. 정상 조직에서 그 변이가 단 한 리드라도 보이면 버립니다. FFPE 잡음과 시퀀싱 오류를 막는 데는 좋지만, 대가가 있습니다 — 정상 점막에 이미 작게 퍼져 있던 변이(밭 효과)는 전부 사라집니다.

High school엄격한 필터의 대가

필터를 세게 걸면 가짜가 줄어듭니다. 그런데 진짜도 같이 사라져요.

필터	거를 수 있는 진짜 변이
정상 대립유전자 = 0	정상 조직에 종양이 조금 섞였으면 진짜도 탈락
COSMIC 등재	새로운 변이는 전부 탈락
빈도 문턱	암세포 비율이 낮은 시료의 진짜 변이

두 번째 줄이 특히 강합니다 — COSMIC에 없으면 아무리 진짜여도 안 셉니다.

13강에서 이 일이 실제로 일어납니다. EGFR 변이가 필터에 지워졌다가, 필터를 풀자 네 명에게서 나왔어요.

예시 자료이지만 순서와 규칙은 논문 Methods 그대로입니다. 마지막 두 줄이 가장 크게 깎습니다.

Python Runs in your browser

# 필터 넷이 차례로 걸러 내는 모습을 봅니다.
# 아래 자료는 예시입니다. 규칙만 논문 그대로입니다.
import numpy as np

rng = np.random.default_rng(17)
N = 30000                              # Mutect2 가 처음 부른 후보

깊이     = rng.poisson(149, N)                 # 논문 평균 깊이 149x
vaf      = np.clip(rng.beta(1.4, 9.0, N), 0, 1)
변이리드 = rng.binomial(깊이, vaf)
정상리드 = rng.binomial(2, 0.08, N)             # 정상에서 새어 나온 리드
pass멤   = rng.random(N) < 0.62                 # Mutect2 자체 PASS
비동의   = rng.random(N) < 0.48
gnomad   = rng.random(N) < 0.11                 # 인구집단에 흔함
cosmic   = rng.random(N) < 0.09                 # COSMIC 에 등재됨

단계 = [
    ("처음 부른 후보",              np.ones(N, bool)),
    ("Mutect2 PASS",               pass멤),
    ("gnomAD 흔한 변이 제외",       ~gnomad),
    ("DepthFilter >= 10",          깊이 >= 10),
    ("tumor VAF >= 0.05",          vaf >= 0.05),
    ("tumor AlleleCount >= 7",     변이리드 >= 7),
    ("normal AlleleCount = 0",     정상리드 == 0),
    ("비동의만",                    비동의),
    ("COSMIC 등재만",               cosmic),
]

남음 = np.ones(N, bool)
print(f"{'단계':<26} {'남은 수':>9} {'이번에 버림':>11}")
print("-" * 50)
for 이름, 조건 in 단계:
    before = 남음.sum()
    남음 = 남음 & 조건
    print(f"{이름:<26} {남음.sum():9,} {before - 남음.sum():11,}")

print()
print("논문의 최종 수: IP 515개  ·  SNSCC 702개")
print("맨 아래 두 줄이 가장 많이 버립니다. 13강에서 그 대가를 봅니다.")

파이프라인 전체

단계	도구	버전
정렬	BWA (GRCh38)	0.7.19
중복 표시 · 인델 재정렬	Picard · GATK	3.3.0 · 4.5.0.0
BAM 색인	SAMtools	1.22.1
염기품질 재보정	GATK BaseRecalibrator (dbSNP 138)	—
체세포 변이 호출	Mutect2 tumor-normal	—
생식세포 제거	정상 패널 + gnomAD (AF ≤ 0.01)	—
필터	FilterMutectCalls → PASS 만	—
효과 주석	snpEff	5.1.0
암 변이 조회	COSMIC + VEP	v102
눈으로 확인	IGV — 후보 전부를 손으로 봤다	—

High school필터의 문턱은 누가 정하나

목적	필터 강도	결과
확실한 것만 보고	강하게	거짓 양성 적음 · 놓치는 것 많음
후보를 넓게 찾기	약하게	진짜를 많이 잡음 · 가짜도 많음
두 번 돌리기	강하게 한 번, 약하게 한 번	이 논문의 방식

한 번의 필터로 답을 정하지 않고, 바꿔 가며 무엇이 나타나는지 보는 것이 정석입니다.

13강이 그 실천입니다. 필터를 바꿔 보니 첫 분석에서 안 보이던 것이 나왔어요.

🤔 Check yourself

논문의 필터 중 normal_AlleleCount = 0 이 가장 엄격한 이유와 그 대가는?

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'COSMIC 등재 변이만 센다' 는 결정이 뜻하는 바는?