4강 / 20강

파라핀 덩어리에서 꺼낸다

논문 Methods · DNA and RNA extraction · 신생물 세포비 70%

병원에서 떼어낸 조직은 거의 전부 이렇게 보관됩니다.

🧪

1. 포르말린에 담근다

단백질끼리 가교가 걸립니다. 모양이 그대로 굳습니다.

🕯️

2. 파라핀에 굳힌다

물을 빼고 초에 담급니다. 상온에서 수십 년 갑니다.

🔪

3. 얇게 썬다

몇 마이크로미터로 잘라 유리판에 붙입니다.

이것을 FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded)라고 합니다. 이 논문의 11명 조직은 전부 FFPE 입니다. 다른 방법이 없었습니다 — 드문 병이라 조직은 과거의 수술 검체 보관소에서 왔습니다.

먼저 칼로 고른다 — 육안절편(macrodissection)

암 조직이라고 해서 전부 암세포인 것은 아닙니다. 그 안에는 정상 상피 · 결합조직 · 혈관 · 면역세포가 섞여 있습니다.

이 섞임 비율을 신생물 세포비(neoplastic cellularity) 라고 합니다. 논문의 규칙은 이렇습니다.

신생물 세포비가 70% 아래면 → 칼로 긁어낸다

병리의사가 슬라이드를 보고 암세포가 몰려 있는 영역을 표시하면, 그 부분만 유리판에서 긁어 모아 핵산을 뽑습니다. 정상세포가 섞이는 만큼 신호가 묽어지기 때문입니다.

고등학생포르말린이 DNA에 하는 일

일어나는 일	결과
DNA와 단백질을 서로 붙임 (교차결합)	DNA를 꺼내기 어려움
DNA가 잘게 부서짐	긴 조각을 못 얻음
시토신이 우라실로 바뀜	가짜 변이가 생김 — C>T
RNA는 더 심하게 분해	발현 분석이 어려움

세 번째 줄이 특히 골칫거리입니다. 실제로는 없는 변이가 자료에 나타나요. 그것도 특정 패턴(C→T)으로요.

FFPE 인공물은 무작위가 아니라 방향이 있어서 진짜 변이처럼 보입니다.

70% 는 안전선입니다. 그 아래로 내려가면 진짜 변이가 문턱 밑으로 사라지기 시작합니다.

Python 브라우저에서 실행

# 섞임이 변이대립빈도를 어떻게 묽히나.
# 종양세포 안에서 한 쪽 대립유전자에만 있는 변이(이형접합)를 가정합니다.

print("종양세포비   기대 VAF   깊이 100 에서 읽힐 변이 리드 수")
print("-" * 52)
for 비율 in [1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1]:
    vaf = 비율 * 0.5              # 이형접합이므로 절반
    리드 = vaf * 100
    표시 = "  <- 논문의 기준선" if abs(비율 - 0.7) < 1e-9 else ""
    print(f"   {비율:5.0%}      {vaf:6.3f}      {리드:5.1f} 개{표시}")

print()
print("논문의 변이 채택 기준: VAF >= 0.05 이고 변이 리드 >= 7개")
print("종양세포비 20% 면 기대 VAF 는 0.10 — 아직 통과합니다.")
print("종양세포비 10% 면 기대 VAF 는 0.05 — 경계에 걸립니다.")

고등학생그래서 필터가 필요하다

11강에서 볼 변이 필터들이 상당 부분 이 문제에 대응하는 것입니다.

필터	거르는 것
읽기 깊이 문턱	몇 개만 읽힌 자리 — 우연일 가능성
대립유전자 빈도 문턱	아주 낮은 비율의 변이 — 인공물 의심
정상 조직에 없을 것	생식세포 변이 제외
알려진 변이 목록 (COSMIC)	이미 암에서 보고된 것만

필터를 세게 걸면 인공물이 줄지만 진짜 변이도 같이 사라집니다. 13강에서 그 일이 실제로 일어납니다 — EGFR 변이가 필터에 지워졌어요.

DNA 와 RNA 를 같은 조각에서 뽑는다

논문이 쓴 것은 AllPrep DNA/RNA FFPE 키트(Qiagen) 입니다. 이름 그대로 한 조직 조각에서 DNA 와 RNA 를 동시에 뽑습니다.

따로 뽑았다면 DNA 를 뽑은 조각과 RNA 를 뽑은 조각이 서로 다른 위치가 됩니다. 그러면 '이 변이가 있는 세포에서 저 유전자가 켜져 있다' 는 말을 하기 어려워집니다.

단계	이 논문에서	왜
보관	FFPE	드문 병 — 과거 검체 보관소에서 왔다
고르기	세포비 <70% 면 육안절편	정상세포 섞임을 줄인다
추출	AllPrep DNA/RNA FFPE	같은 조각에서 둘 다
RNA 라이브러리	TruSeq RNA Access	FFPE·저품질 RNA 전용 — 포획 방식
DNA 라이브러리	SureSelectXT All Exon V6	엑솜 포획
시퀀서	HiSeq 2500 · 2×100bp	짧은 조각에 맞다

고등학생신생물 세포비 70%

또 하나 확인해야 할 것이 있습니다. 떼어 낸 조직에 암세포가 몇 %나 들어 있는가.

조직 안의 세포	왜 섞이나
암세포	우리가 보려는 것
면역세포	종양에 몰려듦
섬유아세포·혈관	종양의 지지 조직
정상 상피	경계 부위에 섞임

암세포가 70%면, 어떤 변이가 모든 암세포에 있어도 자료에서는 35% 정도로 보입니다 (두 벌 중 한 벌만 변이라면).

그래서 병리학자가 현미경으로 보며 암세포 비율을 미리 재 둡니다. 이 값이 나중에 변이 빈도를 해석할 때 기준이 돼요.

🤔 확인 문제

논문이 신생물 세포비 70% 를 기준으로 육안절편을 한 이유는?

🤔 확인 문제

FFPE 조직에서 특히 조심해야 하는 인공 변이는?