6강 / 20강

화산 그림 — 무엇이 얼마나 달랐나

논문 Figure 1A · limma-voom · Q < 0.05

논문의 첫 그림은 화산 그림(volcano plot) 입니다. 유전자 하나가 점 하나입니다. 두 축이 있습니다.

↔️

가로 — 효과 크기

log2 배수변화(LFC). 오른쪽은 올라간 유전자, 왼쪽은 내려간 유전자.
LFC 1 은 두 배, 2 는 네 배입니다.

↕️

세로 — 확실함

−log10(Q). 위로 갈수록 우연일 가능성이 낮습니다.
Q 0.05 는 세로 1.3 자리입니다.

두 축은 독립입니다. 크게 달라졌는데 확실하지 않을 수 있고, 조금 달라졌는데 아주 확실할 수도 있습니다.

고등학생화산 그림이란

차등 발현 결과를 한눈에 보여 주는 그림입니다. 모양이 화산 분출을 닮아서 volcano plot이라고 불러요.

축	나타내는 것
가로 (x)	얼마나 달라졌나 — log2 배수 변화
세로 (y)	얼마나 확실한가 — −log10(p값)

오른쪽 위 = 크게 올랐고 확실함 · 왼쪽 위 = 크게 내렸고 확실함

대부분의 점은 아래 가운데에 뭉쳐 있습니다. 변화도 작고 확실하지도 않은 유전자들이에요. 위로 솟은 점들이 우리가 찾는 것입니다.

고등학생왜 두 축이 다 필요한가

한 축만 보면	생기는 문제
배수 변화만	노이즈로 크게 튄 유전자가 상위에
p값만	아주 작은 차이도 표본이 많으면 유의

두 번째 줄이 중요합니다. 발현이 아주 높은 유전자는 측정이 안정적이라 작은 차이도 통계적으로 유의해요. 그런데 1.05배 차이가 생물학적으로 뜻이 있을까요? 대개 없습니다.

"크다"와 "확실하다"를 둘 다 요구하는 것이 화산 그림의 논리입니다.

논문이 'Benjamini-Hochberg 로 보정한 Q < 0.05' 라고 적은 이유가 이것입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 다중검정 보정이 왜 필요한가 — 직접 세어 봅니다.
import numpy as np
from scipy import stats

rng = np.random.default_rng(42)
유전자수 = 20000
n = 11

# 진짜 차이가 하나도 없는 자료를 만듭니다. (한꺼번에 계산합니다)
차 = rng.normal(0, 1, (유전자수, n)) - rng.normal(0, 1, (유전자수, n))
t = 차.mean(axis=1) / (차.std(axis=1, ddof=1) / np.sqrt(n))
p값 = 2 * stats.t.sf(np.abs(t), df=n - 1)

print(f"진짜 차이가 없는 유전자 {유전자수:,}개를 검정했습니다.")
print(f"  P < 0.05 인 유전자   {int((p값 < 0.05).sum()):,}개")
print(f"  P < 0.01 인 유전자   {int((p값 < 0.01).sum()):,}개")
print()

# 벤야미니-호흐베르크 보정
순서 = np.argsort(p값)
정렬 = p값[순서]
q = 정렬 * 유전자수 / np.arange(1, 유전자수 + 1)
q = np.minimum.accumulate(q[::-1])[::-1]

print(f"  BH 보정 뒤 Q < 0.05  {int((q < 0.05).sum()):,}개")
print()
print("보정 전에는 천 개쯤 나옵니다. 전부 가짜입니다.")

이 논문이 화산 그림에서 본 것

정상 점막을 기준으로 IP 와 SNSCC 를 각각 비교했습니다. 결과는 한 문장으로 요약됩니다.

SNSCC 가 IP 보다 훨씬 크게 달라져 있다

그림 1A 에서 SNSCC 쪽 점들이 더 넓게 퍼지고 더 높이 올라갑니다. 당연해 보이지만 확인이 필요한 사실입니다 — 혹은 정상과 암 사이 어딘가에 있다.

올라간 유전자들 — 이름을 보면 성격이 보인다

무리	유전자	공통점
편평상피 악성 표지	`KRT6A` `FAM83A` `FERMT1` `SFN` `GBP6` `ANLN` `NEK2` `AHNAK2` `FAT2` `SDC1` `S100A7` `SPRR1B` `GSDMC` `TACSTD2`	다른 편평세포암에서 예후가 나쁠 때 오르는 것들
증식·침습·EMT 종양유전자	`TP63` `FAM83A` `NECTIN4` `ROS1` `CCNB1` `CDK1` `PBK` `MMP11`	세포를 더 빨리 나누게 하거나 기어 나가게 하는 것들

KRT6A · SPRR1B 는 각질을 만드는 유전자입니다. CDK1 · CCNB1 는 세포주기를 돌리는 유전자입니다. MMP11 은 세포 밖 그물을 자르는 가위입니다 — 기어 나가려면 필요합니다.

고등학생limma-voom과 Q값

이 논문이 쓴 도구입니다. 두 부분으로 되어 있어요.

부분	하는 일
voom	RNA-seq 자료의 성질(계수 자료, 분산이 평균에 의존)을 보정
limma	선형모형으로 차이를 검정

그리고 Q < 0.05를 씁니다. Q값은 FDR 보정된 p값이에요 — 유전자 2만 개를 검정하니 보정이 필수입니다.

Q < 0.05 = "고른 유전자 중 5% 정도가 가짜일 것"

내려간 유전자들 — 두 무리로 갈린다

무리	유전자	공통점
종양억제 쪽	`SFRP4` `SCARA5` `GPM6A` `ZBTB16` `MEOX2` `MYH11` `FAM107A` `SLC5A8` `DMBT1` `CHRDL1` `LTF` `NR4A1`	증식을 눌러 두던 것들
T·B 세포 신호	`CD19` `CD22` `MS4A1` `FCRLA` `FCRL1` `FCRL2` `FCRL5` `IGLL5` `BLK` `FCMR` `TBX21` `CCL19` `CCL21`	면역세포가 줄었거나 조용해졌다

두 번째 줄이 이 강의에서 계속 따라갈 실입니다. CD19 · MS4A1(CD20) 은 B세포 표지입니다. CCL19 · CCL21 은 면역세포를 불러 모으는 신호입니다. 이것들이 내려갔다는 것은 조직 안에 면역세포가 덜 있다는 뜻입니다.

이 그림의 자료는 예시입니다. 논문의 실제 값은 Supplementary Table 2 에 있습니다.

Python 브라우저에서 실행

# 화산 그림을 직접 그려 봅니다.
# 아래 자료는 논문 값이 아니라, 문턱이 어떻게 걸리는지 보기 위한 예시입니다.
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt

rng = np.random.default_rng(3)
n = 6000

lfc = rng.normal(0, 0.8, n)
# 크게 달라진 유전자일수록 확실할 확률이 높게 만듭니다.
sig = np.abs(lfc) * rng.uniform(0.6, 2.4, n)
q = 10 ** (-sig)
y = -np.log10(np.clip(q, 1e-12, 1))

up = (lfc > 1) & (q < 0.05)
dn = (lfc < -1) & (q < 0.05)

plt.figure(figsize=(7, 4.8))
plt.scatter(lfc[~(up | dn)], y[~(up | dn)], s=5, c="#cbd5e1")
plt.scatter(lfc[up], y[up], s=7, c="#16a34a", label=f"올라감 {up.sum()}")
plt.scatter(lfc[dn], y[dn], s=7, c="#ec4899", label=f"내려감 {dn.sum()}")
plt.axhline(-np.log10(0.05), ls="--", lw=1, c="#94a3b8")
plt.axvline(1, ls="--", lw=1, c="#94a3b8")
plt.axvline(-1, ls="--", lw=1, c="#94a3b8")
plt.xlabel("log2 배수변화")
plt.ylabel("-log10(Q)")
plt.legend(fontsize=8)
plt.title("화산 그림 — 두 문턱이 만드는 네 구역")
plt.show()

print("점선 오른쪽 위 = 올라갔고 확실한 것")
print("점선 왼쪽 위   = 내려갔고 확실한 것")
print("아래 절반은 문턱을 넘지 못한 것 — 크게 달랐어도 버립니다.")

고등학생화산 그림이 감추는 것

안 보이는 것	왜 문제인가
발현의 절대 수준	거의 안 켜진 유전자가 2배 올라도 의미가 적음
개별 표본의 분포	한 표본이 극단적이라 생긴 차이일 수도
환자 간 일관성	11명 중 몇 명에서 그런지
단계의 순서	정상→양성→악성 계단인지, 악성에서만 튄 건지

마지막 줄이 이 연구에서 특히 중요합니다. 화산 그림은 두 무리를 비교하는 도구라, 세 단계의 순서를 못 담아요. 그래서 7강의 다른 자가 필요합니다.

도구가 답할 수 있는 질문의 모양이 물을 수 있는 질문을 정합니다.

🤔 확인 문제

Q < 0.05 로 골라낸 유전자 목록에 대해 맞는 설명은?

🤔 확인 문제

논문이 화산 그림에서 확인한 IP 의 위치는?