Lesson 12 of 20
퓨로마이신 3 µg/ml — 죽음곡선을 먼저 그린다
SI 「Successfully transduced cells were subsequently selected with 3 μg/ml puromycin」
바이러스를 부었다고 모든 세포가 감염되지는 않습니다. 감염된 것과 안 된 것을 어떻게 가를까요?
안 된 것을 다 죽입니다.
1. 전달 벡터에는 shRNA 말고 퓨로마이신 저항 유전자도 실려 있다
2. 감염된 세포는 그 유전자를 갖게 된다
3. 배지에 퓨로마이신을 넣는다
4. 저항 유전자가 없는 세포는 단백질 합성이 멈춰 죽는다
5. 살아남은 것이 곧 감염된 세포
퓨로마이신은 리보솜에서 만들어지는 단백질 사슬 끝에 끼어들어 사슬을 강제로 끊습니다. 저항 유전자는 퓨로마이신을 화학적으로 무력화해요.
죽음곡선(kill curve)을 먼저 그린다
논문은 3 µg/ml 을 썼습니다. 그런데 이 값은 세포주마다 다릅니다. 그래서 실험 전에 죽음곡선을 먼저 그립니다.
1. 감염시키지 않은 세포를 여러 웰에 심는다
2. 퓨로마이신을 0 · 0.5 · 1 · 2 · 4 · 8 µg/ml 로 넣는다
3. 3~7일 지켜본다
4. 3~5일 안에 전부 죽는 가장 낮은 농도를 고른다
왜 '가장 낮은' 일까요? 높은 농도는 감염된 세포에도 부담이기 때문입니다. 저항 유전자가 있어도 무한정 버티지는 못해요.
IC50 을 3.0 으로 바꿔 보세요 (더 잘 버티는 세포주). 필요한 농도가 어떻게 달라질까요?
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퓨로마이신 선별에서 감염시키지 않은 대조 웰을 함께 두는 이유는?
Answer 무감염 웰이 살아 있으면 퓨로마이신이 안 듣고 있다는 뜻입니다. 그러면 선별 후 살아남은 세포를 감염된 것으로 믿을 수 없어요.