19강 / 20강

조작했다는 것을 어떻게 증명하나

mRNA · 단백질 · DNA — 방법마다 봐야 할 곳이 다르다

siRNA 를 넣었다고 넉다운이 된 것은 아닙니다. 확인해야 합니다.

그런데 방법마다 봐야 할 곳이 다릅니다.

방법	무엇이 바뀌나	확인 방법	논문
siRNA	mRNA 가 잘린다	qRT-PCR (mRNA 정량)	Fig. S7A
shRNA	mRNA 가 잘린다	qRT-PCR	Fig. S7B
CRISPR	DNA 가 바뀐다	시퀀싱 · 웨스턴블롯 (단백질)	immunoblotting

CRISPR 이 다른 것을 눈여겨보세요. DNA 를 바꾼 것이므로 mRNA 양은 그대로일 수도 있습니다 — 망가진 mRNA 가 그대로 만들어질 수 있으니까요.

그래서 CRISPR 은 단백질로 확인합니다. 논문도 subject to cellular assays and immunoblotting analysis 라고 적었어요.

고등학생조작했다는 것을 어떻게 증명하나

방법마다 봐야 할 곳이 다릅니다.

방법	확인할 층	기대
siRNA · shRNA	mRNA + 단백질	둘 다 감소
CRISPR KO	DNA + 단백질	서열 변화 + 단백질 소실

CRISPR는 DNA를 자르니 mRNA가 남을 수도 있습니다 — 틀만 어긋난 채로요.

고등학생CRISPR 검증의 순서

단계	방법	알 수 있는 것
1	PCR + 시퀀싱	어떤 삽입·결실이 생겼나
2	서열 해독 (TIDE 등)	틀 이동인가 · 몇 %가 편집됐나
3	웨스턴블롯	단백질이 정말 없나
4	두 대립유전자 확인	한쪽만 편집됐을 수도

세 번째가 결정적입니다 — DNA가 바뀌어도 단백질이 남으면 넉아웃이 아닙니다.

고등학생두 대립유전자 문제

사람과 생쥐 세포는 유전자를 두 벌 가지고 있습니다. 둘 다 망가져야 넉아웃이에요.

상태	이름	단백질
한 벌만 망가짐	이형접합 넉아웃	절반 남음
두 벌 다 망가짐	완전 넉아웃	없음
둘이 다르게 망가짐	복합 이형접합	확인 필요

암세포주는 염색체 수가 뒤틀려 있어 세 벌 이상인 경우도 있습니다.

mRNA 만 보고 '껐다' 고 하면 안 되는 이유입니다.

Python 브라우저에서 실행

# mRNA 를 끄면 단백질은 언제 줄어드나
import numpy as np, matplotlib.pyplot as plt

t = np.linspace(0, 120, 400)

def 단백질(반감기, mRNA줄임=0.9, 넉다운시점=0):
    k = np.log(2) / 반감기
    남은합성 = 1 - mRNA줄임
    # 정상상태 1 에서 시작, 합성이 줄고 분해는 그대로
    return 남은합성 + (1 - 남은합성) * np.exp(-k * np.maximum(t - 넉다운시점, 0))

for 반감기, lab in [(6, "반감기 6h (빠름)"), (24, "반감기 24h"), (72, "반감기 72h (느림)")]:
    plt.plot(t, 단백질(반감기) * 100, label=lab)

plt.axhline(10, color="gray", ls="--", lw=1)
plt.axvspan(48, 72, color="tab:green", alpha=.15, label="흔히 재는 구간")
plt.xlabel("mRNA 를 90% 줄인 뒤 시간 (h)"); plt.ylabel("남은 단백질 (%)")
plt.legend(fontsize=8); plt.grid(alpha=.3); plt.show()

print(f"{'반감기':>7}{'24h':>8}{'48h':>8}{'72h':>8}")
print("-" * 32)
for hl in (6, 24, 72):
    v = [단백질(hl)[np.argmin(abs(t - h))] * 100 for h in (24, 48, 72)]
    print(f"{hl:>6}h{v[0]:>7.0f}%{v[1]:>7.0f}%{v[2]:>7.0f}%")
print()
print("반감기가 72h 인 단백질은 mRNA 를 껐어도 48h 에 아직 절반 넘게 남아 있습니다.")

고등학생논문에서 확인할 것

확인	왜
넉다운 효율이 수치로 있나	7강 — "껐다"만으로는 부족
단백질 수준에서 봤나	mRNA만으로는 불충분
서열이 여러 개인가	16강 — 오프타깃
대조군이 명시됐나	4강
KO는 서열을 확인했나	위

검증 자료가 보충자료에 있는 경우가 많습니다 — 본문에 없다고 안 한 것은 아닙니다.

🤔 확인 문제

CRISPR 넉아웃을 qRT-PCR 로만 확인하면 안 되는 이유는?