12강 / 20강

퓨로마이신 3 µg/ml — 죽음곡선을 먼저 그린다

SI 「Successfully transduced cells were subsequently selected with 3 μg/ml puromycin」

바이러스를 부었다고 모든 세포가 감염되지는 않습니다. 감염된 것과 안 된 것을 어떻게 가를까요?

안 된 것을 다 죽입니다.

1. 전달 벡터에는 shRNA 말고 퓨로마이신 저항 유전자도 실려 있다

2. 감염된 세포는 그 유전자를 갖게 된다

3. 배지에 퓨로마이신을 넣는다

4. 저항 유전자가 없는 세포는 단백질 합성이 멈춰 죽는다

5. 살아남은 것이 곧 감염된 세포

퓨로마이신은 리보솜에서 만들어지는 단백질 사슬 끝에 끼어들어 사슬을 강제로 끊습니다. 저항 유전자는 퓨로마이신을 화학적으로 무력화해요.

고등학생죽음곡선을 먼저 그린다

퓨로마이신 농도는 세포주마다 다릅니다. 미리 정해야 해요.

단계	하는 일
1	유전자를 안 넣은 세포를 여러 웰에 심음
2	퓨로마이신 농도를 단계별로 (0.5 · 1 · 2 · 3 · 5 µg/ml)
3	3~5일 관찰
4	전부 죽는 최소 농도를 고름

이것을 킬 커브라고 합니다 — 안 하면 선별이 헐겁거나 너무 셉니다.

고등학생퓨로마이신의 작동 원리

단계	내용
퓨로마이신	아미노산 유사체 — 리보솜에서 단백질 사슬에 끼어듦
결과	사슬이 끊겨 불완전한 단백질이 나옴
내성 유전자 (pac)	퓨로마이신을 화학적으로 무력화

퓨로마이신은 빠릅니다 — 2~3일이면 선별이 끝납니다.

다른 항생제(G418, 하이그로마이신)는 1~2주가 걸려요. 그래서 퓨로마이신을 선호합니다.

죽음곡선(kill curve)을 먼저 그린다

논문은 3 µg/ml 을 썼습니다. 그런데 이 값은 세포주마다 다릅니다. 그래서 실험 전에 죽음곡선을 먼저 그립니다.

1. 감염시키지 않은 세포를 여러 웰에 심는다

2. 퓨로마이신을 0 · 0.5 · 1 · 2 · 4 · 8 µg/ml 로 넣는다

3. 3~7일 지켜본다

4. 3~5일 안에 전부 죽는 가장 낮은 농도를 고른다

왜 '가장 낮은' 일까요? 높은 농도는 감염된 세포에도 부담이기 때문입니다. 저항 유전자가 있어도 무한정 버티지는 못해요.

IC50 을 3.0 으로 바꿔 보세요 (더 잘 버티는 세포주). 필요한 농도가 어떻게 달라질까요?

Python 브라우저에서 실행

# 죽음곡선에서 알맞은 농도를 고른다
import numpy as np, matplotlib.pyplot as plt

농도 = np.array([0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8])       # µg/ml
날 = np.array([1, 3, 5, 7])

# 감염 안 된 세포의 생존율 (모형): 농도와 시간에 따라 준다
def 생존(c, d, ic50=1.6, k=2.2):
    사멸속도 = (c ** k) / (ic50 ** k + c ** k)
    return np.exp(-사멸속도 * d * 0.95)

for d in 날:
    plt.plot(농도, [생존(c, d) * 100 for c in 농도], "o-", label=f"{d}일")
plt.axhline(2, color="tab:red", ls="--", label="사실상 전멸")
plt.xlabel("퓨로마이신 (µg/ml)"); plt.ylabel("감염 안 된 세포의 생존율 (%)")
plt.legend(); plt.grid(alpha=.3); plt.show()

print("3~5일 안에 전멸하는 가장 낮은 농도를 찾는다")
for c in 농도:
    s3, s5 = 생존(c, 3) * 100, 생존(c, 5) * 100
    판정 = "OK — 이 값을 쓴다" if s5 < 2 and s3 < 20 else ("너무 약하다" if s5 >= 2 else "충분")
    표 = "  ← 논문" if c == 3 else ""
    print(f"  {c:>4.1f} µg/ml   3일 {s3:5.1f}%   5일 {s5:5.1f}%   {판정}{표}")

고등학생농도가 어긋나면

농도가	결과
낮음	감염 안 된 세포도 살아남음 — 혼합 집단
적절	감염된 것만 남음
높음	감염된 세포도 죽음 — 다 잃음

낮은 쪽 실수가 더 위험합니다 — 모르는 채로 실험이 진행됩니다.

선별 후에 대조군(감염 안 한 세포)이 다 죽었는지 반드시 확인해야 해요. 살아 있으면 선별이 안 된 겁니다.

고등학생선별 후 확인할 것

확인	방법	왜
대조군이 다 죽었나	눈으로	선별이 작동했나
shRNA가 발현되나	—	내성만 발현될 수도
표적이 실제로 줄었나	qPCR · 웨스턴	가장 중요

항생제를 이겨 냈다는 것이 표적이 줄었다는 뜻은 아닙니다 — 19강에서 검증합니다.

🤔 확인 문제

퓨로마이신 선별에서 감염시키지 않은 대조 웰을 함께 두는 이유는?