Lesson 4 of 20

체세포 변이 부르기 — 두 파일의 뺄셈

제6장 「소매틱 배리언트 콜링」 · GATK Mutect2

이야기의 문장은 이렇습니다.

"두 파일을 나란히 놓고, 종양에서만 나타나는 변이를 찾아내는 것. 소매틱 배리언트 콜링(somatic variant calling)이라고 불리는 작업이었다."

학생들이 여기서 멈춥니다. 낱말을 셋으로 쪼개면 다 풀립니다.

낱말	뜻	비유
체세포(somatic)	태어난 뒤 몸의 어느 세포에서 생긴 변이. 자손에게 안 간다	책을 베껴 쓰다 난 오타
생식세포(germline)	태어날 때부터 온몸의 모든 세포에 있는 변이	원본에 원래 있던 글자
부르기(calling)	read 더미를 보고 "여기 변이가 있다"고 판정하는 일	오타를 빨간 펜으로 표시하는 일

High school타고난 오타와 나중에 생긴 오타

이 강의 전체에서 가장 중요한 구별입니다. 딱 두 가지입니다.

	생식세포 변이	체세포 변이
언제 생겼나	태어날 때부터	태어난 뒤, 어떤 세포에서
어디에 있나	온몸 모든 세포	그 세포와 그 자손만
자식에게 가나	간다	안 간다
비유	원본에 원래 있던 글자	베껴 쓰다 난 오타

왜 이 구별이 목숨을 좌우하나

백신은 몸에게 "이걸 공격해" 라고 가르치는 것입니다. 그런데 타고난 것을 가리키면? 온몸의 정상 세포가 다 공격당합니다.

'종양에만 있는 것' 을 찾는 게 아니라, '나에게 없는 것' 을 찾는 것입니다

High school혈액이 왜 필요한가 — 틀린그림찾기의 원본

틀린그림찾기를 생각해 보세요. 그림 한 장만 주고 "틀린 곳을 찾으시오" 하면 풀 수가 없습니다. 무엇이 맞는 건지 모르니까요.

두 장을 나란히 놓아야 다른 곳이 보입니다.

틀린그림찾기	이 이야기
왼쪽 그림 (원본)	혈액 — 로지가 원래 이렇다
오른쪽 그림	종양
다른 곳 5군데	체세포 변이 4,847개

비유가 깨지는 자리

틀린그림찾기는 다른 곳이 정확히 다섯 개라고 알려 줍니다. 여기서는 몇 개인지 아무도 모릅니다. 게다가 그림이 흐려서 "다른 것 같기도 하고 아닌 것 같기도 한" 자리가 수천 군데 나옵니다. Mutect2 가 하는 일이 그 흐릿함을 확률로 다루는 것입니다.

GATK Mutect2 가 하는 일

GATK 는 Broad Institute 가 만든 유전체 분석 도구 묶음이고, Mutect2 는 그중 체세포 변이 전용 부름꾼입니다. tumor-normal paired mode 는 두 파일을 같이 본다는 뜻입니다.

gatk Mutect2 \
    -R CanFam3.1.fa \
    -I tumor_dedup.bam -tumor rosie_tumor \
    -I blood_dedup.bam -normal rosie_blood \
    -O raw_somatic.vcf

gatk FilterMutectCalls -R CanFam3.1.fa -V raw_somatic.vcf -O filtered.vcf

Mutect2 는 자리마다 이 물음을 묻습니다.

귀무가설: 이 자리에는 체세포 변이가 없다. 종양의 이상한 read 는 전부 기계 오류다.

대립가설: 종양 세포의 일정 비율 f 가 이 변이를 갖고 있다.

두 가설 아래에서 지금 본 read 더미가 나올 확률을 각각 계산하고, 비율(우도비)이 충분히 크면 변이라고 부릅니다. 그리고 같은 자리에서 정상 샘플에 그 변이가 보이면 즉시 탈락시킵니다 — 생식세포 변이니까요.

VAF — 이야기에서 가장 자주 나오는 숫자

VAF = 변이를 담은 read 수 ÷ 그 자리를 덮은 전체 read 수

VAF(Variant Allele Frequency, 변이 대립유전자 빈도). KIT D816V 의 VAF 는 0.847 이었습니다. 이 숫자 하나가 이야기의 방향을 정합니다.

VAF	보통 무슨 뜻인가
~0.50	종양 세포 거의 전부가 갖고 있고, 두 벌 중 한 벌에만 변이가 있다
~1.00	종양 세포 전부가 두 벌 다 변이거나, 정상 벌을 잃었다
0.05~0.20	종양 세포 일부에만 있다 — 나중에 생긴 변이(subclonal)
<0.05	기계 오류와 구별하기 어렵다. 보통 버린다

0.847 은 이상하게 높습니다. 순수한 종양이고 한 벌만 변이라면 0.5 여야 하니까요. 높게 나오는 이유는 대개 둘입니다 — 종양 세포가 정상 벌을 잃었거나(LOH), 그 자리의 염색체를 여러 벌 복제했거나. 어느 쪽이든 뜻은 같습니다. 이 변이는 종양이 붙들고 놓지 않는다.

관측 VAF 는 진짜 VAF 주변에서 흔들립니다. 깊이가 낮을수록 더 크게 흔들립니다.

Python Runs in your browser

# read 더미에서 VAF 를 세고, 그 숫자로 판정까지 해 봅니다.
import numpy as np
from scipy.stats import binom

rng = np.random.default_rng(816)
ERR = 0.001          # 시퀀서 오류율 0.1%

def pileup(depth, true_vaf, rng):
    # 진짜 변이 read + 오류로 생긴 가짜 변이 read
    real = rng.binomial(depth, true_vaf)
    fake = rng.binomial(depth - real, ERR)
    return real + fake

cases = [("KIT D816V", 85, 0.847), ("TP53 R248W", 85, 0.612),
         ("RAS G12D", 85, 0.201), ("잡음 자리", 85, 0.0)]

print(f'{"자리":<12}{"깊이":>5}{"변이read":>9}{"관측VAF":>9}{"오류일확률":>12}')
for name, depth, vaf in cases:
    alt = pileup(depth, vaf, rng)
    obs = alt / depth
    # 전부 시퀀서 오류였을 확률 (귀무가설)
    p_err = 1 - binom.cdf(alt - 1, depth, ERR) if alt > 0 else 1.0
    print(f"{name:<12}{depth:>5}{alt:>9}{obs:>9.3f}{p_err:>12.2e}")
print()
print("잡음 자리는 확률이 1 에 가깝고, 진짜 변이는 0 에 붙습니다.")
print("Mutect2 가 하는 일이 정확히 이 판정입니다 -- 다만 훨씬 정교하게.")

High school위 코드가 방금 무슨 일을 했나요

한 자리를 덮은 read 85개 중 변이 글자를 담은 게 몇 개인지 세고, 그 비율(VAF)을 계산했습니다. 그리고 "이게 전부 기계 오류일 확률"도 냈습니다.

마지막 칸을 보세요.

자리	오류일 확률	판정
KIT · TP53 · RAS	0 에 가까움 (10^-30 같은 값)	진짜 변이
잡음 자리	1 에 가까움	그냥 오류

10^-30 같은 숫자를 어떻게 읽나요

"우연히 이런 일이 벌어질 확률" 입니다. 1 뒤에 0 이 서른 개 붙은 수분의 1. 사실상 0 이라는 뜻입니다. 반대로 잡음 자리는 확률이 1 에 가까우니 얼마든지 우연히 나올 수 있다는 뜻이고요.

이야기의 명령줄에 숨은 함정 하나

소설의 코드에는 --germline-resource af-only-gnomad.vcf.gz 가 들어 있습니다. gnomAD 는 사람의 집단 유전체 빈도표입니다. 개에는 그런 자료가 사실상 없습니다.

이 옵션이 하는 일은 "이 자리는 사람 집단에서 흔한 변이니까 체세포 변이가 아닐 것" 이라고 미리 깎아 주는 것입니다. 개 자료가 없으면 이 안전장치가 통째로 빠집니다. 그러면 로지의 품종에 흔한 생식세포 변이가 체세포 변이로 잘못 불릴 위험이 커집니다.

다행히 혈액 샘플이 그 구멍의 대부분을 막아 줍니다. 하지만 사람용 파이프라인을 다른 종에 그대로 옮길 때 무엇이 조용히 빠지는지를 보여 주는 좋은 예입니다.

결과 — 4,847개

# 필터 통과한 somatic variant: 4,847개

많습니다. 그리고 이 숫자는 거의 전부 쓸모없습니다.

4,847개 중 대부분은 유전자가 아닌 자리에 떨어졌거나, 유전자 안이어도 단백질을 안 바꾸거나, 바꿔도 아무 일도 안 일어나는 변이입니다. 종양이 암이라서 생긴 게 아니라 그냥 세포가 빨리 분열하다 보니 생긴 오타들입니다.

다음 강에서 이 4,847개를 단백질의 말로 번역합니다. 그게 VEP 입니다.

High schoolVAF 0.847 이 이상하게 높다는 게 무슨 뜻인가

사람도 개도 유전자를 두 벌 갖고 있습니다. 엄마한테 한 벌, 아빠한테 한 벌.

그러니 종양 세포 전부가 한 벌만 변이라면 VAF 는 0.5 여야 합니다. read 절반은 정상 벌에서, 절반은 변이 벌에서 오니까요.

그런데 0.847 이 나왔습니다

둘 중 하나입니다.

가능성	무슨 일
정상 벌을 잃었다	종양 세포가 정상 쪽 염색체를 버렸다
변이 벌을 늘렸다	변이 쪽 염색체를 여러 벌 복사했다

어느 쪽이든 결론은 같습니다. 종양이 이 변이를 붙들고 놓지 않았다. 그럴 만큼 이 변이가 종양에게 중요하다는 뜻이고, 그래서 좋은 표적이 됩니다.

종양이 애써 지키는 것 = 종양이 버릴 수 없는 것 = 좋은 표적

🤔 Check yourself

Mutect2 가 tumor-normal 짝 방식으로 도는 가장 중요한 이유는?

🤔 Check yourself

KIT D816V 의 VAF 가 0.847 로 나왔습니다. 이 값이 0.5 보다 훨씬 높은 것이 시사하는 바로 가장 자연스러운 것은?