Lesson 15 of 20

IVT — 시험관에서 mRNA 를 만든다, 그리고 RIN 으로 잰다

제11장 「IVT 반응으로 mRNA를 합성했다. 수율 148 µg/mL. RIN 8.4」

서열이 정해졌습니다. 이제 그 서열을 가진 RNA 분자를 실제로 만들어야 합니다.

IVT(In Vitro Transcription, 시험관 내 전사). 이름 그대로입니다. 세포 안에서 일어나는 전사를 튜브 안에서 재현합니다.

High school튜브 하나에 재료를 넣고 두 시간

서열이 정해졌으니 이제 실제로 만들어야 합니다. 방법은 놀랍게 단순합니다.

튜브 하나에 재료를 넣고, 37 ℃ 에 두 시간 둔다.

넣는 것	요리로 치면
DNA 주형	레시피
T7 중합효소	요리사
A·C·G·U 재료	식재료
RNase 억제제	음식을 훔쳐 먹는 것을 막는 뚜껑

RNase 억제제가 왜 필요한가

RNA 를 자르는 효소(RNase)가 손·먼지·침·공기 어디에나 있기 때문입니다. 실험자가 말 한마디만 해도 침방울로 들어옵니다. RNA 실험이 까다롭기로 유명한 이유예요.

반응 조성 — 한 줄씩 무엇인가

반응 조성 (37 C, 2시간):
  선형화된 DNA 주형         2 ug
  T7 RNA Polymerase         2 uL
  ATP / CTP / GTP           각 7.5 mM
  N1-methylpseudoUTP        7.5 mM
  m7G Cap analog            4 mM
  RNase inhibitor
  총 반응 부피: 100 uL

재료	노릇	왜 그것인가
선형화된 DNA 주형	베낄 원본	선형화가 핵심. 고리 모양(플라스미드)이면 중합효소가 끝없이 돈다
T7 RNA Polymerase	DNA 를 읽어 RNA 를 만든다	박테리오파지 T7 의 효소. 단백질 하나로 혼자 다 한다 — 그래서 시험관에서 쉽다
ATP·CTP·GTP	재료 뉴클레오타이드	7.5 mM 은 넉넉한 농도. 모자라면 짧은 것만 나온다
N1-메틸슈도UTP	U 대신 넣는 변형 뉴클레오타이드	아래 따로
m7G 캡 유사체	5' 끝에 붙는 모자	번역 개시 손잡이 + 자기 RNA 신분증
RNase 억제제	RNA 분해효소를 막는다	RNase 는 손·먼지·공기 어디에나 있다. 없으면 만들자마자 사라진다

N1-메틸슈도유리딘 — 이 이야기에서 가장 중요한 화학 하나

몸에는 바이러스 RNA 를 알아채는 감시기가 있습니다 (TLR7·TLR8·RIG-I 같은). 그냥 mRNA 를 주사하면 이 감시기들이 즉시 알아보고 염증을 일으키며 분해합니다. 문제 1(면역원성)이 이것입니다.

그런데 U 를 N1-메틸슈도유리딘으로 통째로 바꿔 넣으면 감시기가 덜 알아봅니다. 만들어지는 단백질은 똑같은데 면역 감시만 피합니다. 게다가 번역 효율도 올라갑니다.

이 발견이 카탈린 카리코와 드루 와이스먼의 업적이고, COVID-19 mRNA 백신이 작동한 핵심 이유이며, 2023년 노벨 생리의학상을 받았습니다. 이야기의 이 한 줄에 그 역사가 들어 있습니다.

High school노벨상을 받은 한 글자 바꿔치기

재료 목록에 이상한 게 있습니다. U 대신 N1-메틸슈도유리딘이라는 것을 넣었어요.

왜 U 를 안 쓰나

우리 몸에는 바이러스 RNA 를 알아채는 감시기가 있습니다. 그냥 mRNA 를 주사하면 감시기가 즉시 알아보고 열을 내며 부숴 버립니다.

그런데 U 를 살짝 바꾼 것으로 넣으면 감시기가 잘 못 알아봅니다. 만들어지는 단백질은 똑같은데 감시만 피하는 거예요.

	보통 U	N1-메틸슈도U
단백질	완전히 같음
몸이 알아보나	즉시	잘 못 알아봄

이 발견을 한 카리코 커털린과 드루 와이스먼이 2023년 노벨 생리의학상을 받았습니다. COVID-19 백신이 작동한 핵심 이유이기도 합니다.

이야기의 재료 목록 한 줄에 노벨상 하나가 들어 있습니다

수율과 품질 — 다른 이야기다

Nanodrop: 148 ug/mL   (얼마나 많이 나왔나)
무결성(RIN): 8.4/10   (얼마나 온전한가)
잔류 DNA: < 0.1%      (주형이 남아 있나)

세 줄이 서로 다른 세 가지를 잽니다. 학생들이 자주 뭉뚱그립니다.

⚖️

수율 (Nanodrop)

양. 260 nm 흡광도로 잽니다. 부서진 조각도 같이 셉니다

📏

무결성 (RIN)

온전함. 통째로 있는지, 토막 났는지

🧹

잔류 DNA

순도. 주형 DNA 가 남으면 그것도 면역 반응을 일으킵니다

흡광도만 보면 완전히 속습니다. RNA 가 전부 잘게 부서져 있어도 260 nm 흡광도는 똑같이 나옵니다. 그래서 양과 온전함을 따로 재는 것입니다.

RIN — RNA 무결성 지수

RIN(RNA Integrity Number) 은 1~10 사이의 값입니다. 10이 가장 온전합니다.

재는 방법은 전기영동입니다. RNA 를 젤이나 미세관에 넣고 전기를 걸면, 짧은 것이 빨리, 긴 것이 천천히 갑니다. 그래서 길이별 분포가 그래프로 나옵니다.

온전한 RNA

기대한 길이에 봉우리 하나가 뾰족하게 섭니다. 짧은 쪽에는 거의 아무것도 없습니다.

분해된 RNA

봉우리가 낮고 뭉개지고, 짧은 쪽에 부스러기 언덕이 생깁니다. RIN 이 떨어집니다.

RIN	보통 판정
9~10	매우 온전
7~9	대부분의 용도에 충분 — 이야기의 8.4 가 여기
5~7	용도에 따라 위험
< 5	많이 분해됨. 다시 만드는 게 낫다

RIN 을 IVT mRNA 에 쓰는 것은 사실 원래 용도가 아니다

RIN 알고리즘은 진핵세포 총 RNA를 위해 만들어졌습니다. 총 RNA 에는 18S 와 28S 리보솜 RNA 라는 크고 뚜렷한 봉우리 두 개가 있고, RIN 은 그 두 봉우리의 모양과 비율을 주로 봅니다.

IVT 로 만든 mRNA 에는 18S·28S 가 아예 없습니다. 봉우리는 하나뿐입니다. 그러니 RIN 값이 나오기는 나오지만, 그 값이 원래 정의대로 계산된 것은 아닙니다.

실무에서는 이런 이유로 IVT mRNA 의 품질을 RIN 하나로 판정하지 않습니다. 전기영동 그래프를 직접 보고, 온전한 길이의 비율(% full-length)을 따로 세고, 캡이 제대로 붙었는지(capping efficiency), 이중가닥 RNA 부산물이 얼마나 있는지를 따로따로 봅니다.

이야기의 RIN 8.4 는 "쓸 만하다"는 뜻의 편한 요약으로 읽는 것이 맞습니다. 엄밀한 규격값으로 읽으면 안 됩니다.

High schoolRIN 8.4 를 곧이곧대로 믿으면 안 되는 이유

RIN 은 RNA 가 얼마나 온전한가 를 1~10 으로 매긴 점수입니다. 8.4 면 좋은 값이에요.

그런데 이 점수는 원래 다른 용도로 만들어졌습니다

RIN 은 세포에서 뽑은 총 RNA 를 채점하려고 만들어졌습니다. 총 RNA 에는 크고 뚜렷한 봉우리 두 개(18S, 28S)가 있고, RIN 은 주로 그 두 봉우리를 봅니다.

그런데 IVT 로 만든 mRNA 에는 그 두 봉우리가 아예 없습니다. 봉우리는 하나뿐이에요.

	있어야 할 것	실제
총 RNA	18S · 28S 봉우리	있음 ✓
IVT mRNA	18S · 28S 봉우리	없음

그래서 이야기의 RIN 8.4 는 "쓸 만하다" 는 뜻의 편한 요약으로 읽는 게 맞습니다. 엄밀한 규격값은 아니에요.

채점 기준이 다른 시험지에 그 기준을 그대로 쓰면 안 됩니다

봉우리가 무너지고 왼쪽에 부스러기 언덕이 생기는 것 — 그게 RIN 이 보는 모양입니다.

Python Runs in your browser

# 전기영동 그래프를 그려 보고, 왜 흡광도만으로는 속는지 눈으로 봅니다.
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt

L = np.linspace(50, 1400, 500)          # 길이 (nt)
FULL = 950                              # 우리 구조체의 기대 길이

def profile(frac_intact):
    # 온전한 것 봉우리 + 무작위로 잘린 부스러기
    peak = np.exp(-((L-FULL)/28)**2) * frac_intact
    debris = (1-frac_intact) * np.exp(-(L-80)/320) * (L < FULL)
    return peak + debris*0.9

fig, ax = plt.subplots(figsize=(8, 3))
for f, lab, c in ((0.93, "RIN ~8.4 (story)", "seagreen"),
                  (0.55, "RIN ~5",  "goldenrod"),
                  (0.20, "RIN ~2",  "indianred")):
    y = profile(f)
    ax.plot(L, y/y.max(), color=c, lw=1.8, label=lab)
ax.axvline(FULL, ls="--", c="gray"); ax.set_xlabel("length (nt)")
ax.set_ylabel("signal"); ax.legend(fontsize=8); plt.tight_layout(); plt.show()

print(f'{"온전 비율":>10}{"총 RNA 량(흡광도)":>20}{"쓸 수 있는 양":>16}')
for f in (0.93, 0.55, 0.20):
    total = 148.0                       # ug/mL -- 흡광도는 부서진 것도 같이 셉니다
    usable = total * f
    print(f"{f*100:>9.0f}%{total:>18.0f}{usable:>16.0f}  ug/mL")
print()
print("세 줄 다 Nanodrop 은 148 이라고 답합니다. 실제 쓸 수 있는 양은 전혀 다릅니다.")

High school위 코드가 방금 무슨 일을 했나요

전기영동 그래프를 세 가지 그렸습니다. 온전한 것부터 많이 부서진 것까지.

모양	뜻
봉우리 하나가 뾰족	온전함 — RIN 높음
봉우리가 낮고 왼쪽에 언덕	부서짐 — RIN 낮음

아래 표가 이 강의 핵심입니다

세 경우 모두 흡광도(Nanodrop)는 148 로 똑같이 나옵니다. 그런데 실제로 쓸 수 있는 양은 전혀 다릅니다.

흡광도는 염기가 몇 개 있나 를 셉니다. 1000글자짜리 하나든, 100글자짜리 열 개든 염기 개수는 같습니다.

양과 온전함은 다른 물음입니다 — 다른 방법으로 재야 합니다

과일 1 kg 을 샀는데 전부 으깨져 있다면? 무게는 맞지만 못 먹습니다. 무게만 재고 상태를 안 보면 속습니다.

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Nanodrop 흡광도로 148 µg/mL 이 나왔는데도 RIN 을 따로 재야 하는 이유는?

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IVT 반응에서 U 대신 N1-메틸슈도유리딘을 넣는 주된 목적은?