3강 / 20강

200기가바이트 — 조각을 제자리에 놓는다

제6장 「200기가바이트의 세계」

이메일이 왔습니다. 첨부파일 네 개.

rosie_blood_R1.fastq.gz   (48 GB)
rosie_blood_R2.fastq.gz   (51 GB)
rosie_tumor_R1.fastq.gz   (52 GB)
rosie_tumor_R2.fastq.gz   (55 GB)

합쳐서 200 GB. 이 안에 뭐가 들었는지부터 봅니다.

고등학생책을 잘게 찢어 놓고 원래 순서를 맞추는 일

시퀀싱 기계는 DNA 를 처음부터 끝까지 죽 읽지 못합니다. 긴 책을 통째로 못 읽고, 잘게 찢어서 조각만 읽는 것과 같습니다.

책으로 치면	DNA 로 치면
책을 잘게 찢는다	DNA 를 잘게 부순다
조각마다 열다섯 글자씩 읽는다	read 하나가 150 글자
조각이 수십억 개, 순서는 뒤죽박죽	read 수십억 개
같은 책 완본을 옆에 놓고 맞춘다	참조 게놈에 정렬한다

비유가 깨지는 자리

책 조각은 한 번만 찢지만, DNA 는 같은 자리를 수십 번 읽습니다. 일부러 그렇게 합니다 — 한 번 읽어서는 기계가 잘못 읽은 건지 알 수 없으니까요. 그 '몇 번 읽었나' 가 바로 커버리지 입니다.

퍼즐 조각과 답안지

정렬(alignment)은 그 조각들을 참조 게놈 위에 늘어놓는 일입니다.

🧩

조각 수십억 개

150글자짜리 read. 어디서 왔는지 안 적혀 있다

📄

참조 게놈

개 표준 유전체 CanFam3.1. 완성된 퍼즐 그림

📍

정렬 결과 (BAM)

조각마다 몇 번 염색체 몇 번째 자리인지 적어 놓은 것

bwa mem -t 16 CanFam3.1.fa rosie_tumor_R1.fastq.gz rosie_tumor_R2.fastq.gz \
    | samtools sort -o tumor.bam

이야기에서 이 계산에 이틀이 걸렸습니다.

고등학생참조 게놈은 '정답지' 가 아니라 '남의 답안지' 다

정렬하려면 완성된 그림이 있어야 합니다. 그게 참조 게놈(CanFam3.1)입니다.

그런데 이 참조는 어떤 개 한 마리에서 만든 것입니다. 로지가 그 개와 품종이 다르면 안 맞는 자리가 생깁니다.

이게 왜 문제가 되나요

안 맞는 자리가 "변이" 로 보이기 때문입니다. 사실은 그냥 개마다 다른 부분인데, 프로그램은 "여기 뭔가 바뀌었다" 고 표시합니다.

이 이야기가 로지의 피도 같이 읽은 이유가 여기 있습니다. 피와 종양을 둘 다 참조에 맞춰 보면, 참조 탓에 생긴 오해는 양쪽에 똑같이 나타나서 4강에서 자동으로 지워집니다.

잘못된 자를 써도, 두 물건을 같은 자로 재면 '차이' 는 맞습니다

커버리지 — 같은 자리를 몇 번 읽었나

이야기에 나오는 혈액 40×, 종양 85× 가 이겁니다. 게놈의 한 자리를 평균 몇 개의 read 가 덮고 있는지입니다.

커버리지 = (read 개수 × read 길이) ÷ 게놈 크기

왜 종양을 두 배 넘게 깊이 읽었을까요? 종양은 순수하지 않기 때문입니다.

떼어 낸 종양 조각 안에는 종양 세포만 있는 게 아닙니다. 정상 결합조직, 혈관, 침윤한 면역세포가 섞여 있습니다. 게다가 종양 세포끼리도 유전자가 다릅니다(종양 내 이질성). 그래서 일부 세포에만 있는 변이는 read 백 개 중 몇 개에만 나타납니다. 깊이 읽지 않으면 그 몇 개가 아예 안 잡히거나, 잡혀도 기계 오류와 구별되지 않습니다.

결론이 뒤집히는 자리는 VAF 가 낮을 때뿐입니다. 그래서 종양만 85× 로 읽었습니다.

Python 브라우저에서 실행

# 커버리지가 낮으면 왜 변이를 놓치는가 -- 이항분포로 바로 계산됩니다.
from scipy.stats import binom

def miss_prob(depth, vaf, need=3):
    # need 개 미만으로 잡히면 사실상 놓친다 (기계 오류와 구별 불가)
    return binom.cdf(need-1, depth, vaf)

print("변이가 종양 세포의 10%에만 있을 때 (VAF 0.10)")
print(f'{"깊이":>6} {"놓칠 확률":>12}')
for d in [10, 20, 40, 85, 150]:
    print(f"{d:>5}x {miss_prob(d, 0.10)*100:>11.1f}%")
print()
print("VAF 0.847 (KIT D816V) 는 40x 로도 놓칠 일이 없습니다:")
print(f"  40x  ->  {miss_prob(40, 0.847)*100:.6f}%")
print()
print("깊이는 '흔한 변이'를 위한 게 아니라 '드문 변이'를 위한 것입니다.")

고등학생위 코드가 방금 무슨 일을 했나요

커버리지가 낮으면 왜 변이를 놓치는지 확률로 계산했습니다.

표의 두 번째 칸이 놓칠 확률입니다. 위에서 아래로 읽으면 급격히 떨어집니다.

깊이	VAF 0.10 짜리 변이를 놓칠 확률
10×	매우 높음
40×	꽤 낮아짐
85×	거의 0

그런데 마지막 줄을 꼭 보세요

VAF 0.847 짜리(KIT D816V)는 40× 로도 놓칠 일이 없습니다.

즉 깊이 85× 는 KIT 을 찾기 위한 게 아니었습니다. 혹시 있을지 모를 드문 변이를 놓치지 않으려고 지불한 값입니다. 결과적으로는 흔한 변이가 답이었으니 그 돈이 헛돈처럼 보이지만, 미리 알 수 없었기 때문에 낸 보험료입니다.

중복 제거 — 같은 조각을 여러 번 센 것

picard MarkDuplicates I=tumor.bam O=tumor_dedup.bam M=tumor_metrics.txt

라이브러리를 만들 때 PCR 로 DNA 를 증폭합니다. 그러다 보면 원본 조각 하나가 사본 열 개가 되어 기계에 들어갑니다. 정렬하면 똑같은 자리에 똑같은 조각이 열 개 쌓입니다.

독립된 read 10개

서로 다른 DNA 분자 10개를 읽은 것. 증거 10개입니다.

복제된 read 10개

DNA 분자 하나를 열 번 베낀 것. 증거는 여전히 1개인데 프로그램은 10개로 셉니다. 오류 하나가 확신에 찬 변이가 됩니다.

중복 제거를 안 하면 4강의 변이 부르기가 가짜 변이를 자신 있게 내놓습니다. 이 한 줄을 빼먹는 것이 초심자가 가장 흔히 하는 실수입니다.

고등학생PCR 중복 — 시험지를 복사해서 열 장 내는 것

반 친구 한 명의 답안지를 복사해서 열 장 만들었다고 해 봅시다. 그리고 "열 명이 같은 답을 썼으니 맞는 답이겠지" 라고 하면 될까요?

안 됩니다. 독립적인 증거가 아니라 한 사람의 답이니까요.

PCR 중복이 정확히 이겁니다

DNA 를 증폭할 때 원본 조각 하나가 사본 열 개가 됩니다. 원본에 기계가 잘못 읽은 글자 하나가 있었다면, 그 오류가 열 번 복사됩니다.

프로그램 눈에는 "열 개의 read 가 여기 변이가 있다고 한다" 로 보입니다. 확신에 찬 가짜 변이가 만들어집니다. MarkDuplicates 한 줄이 그 사본들을 찾아 하나로 세라고 표시해 줍니다.

증거가 열 개인 것과, 증거 하나를 열 번 말한 것은 다릅니다

🤔 확인 문제

종양을 혈액보다 두 배 넘게 깊이 읽은 가장 큰 이유는?

🤔 확인 문제

PCR 중복 read 를 제거하지 않으면 무슨 일이 생기나요?