Lesson 5 of 20

Table S5 를 뜯어본다 — 프라이머 열 쌍

SI Table S5 「List of primers used in this study」

논문 Table S5 에는 프라이머 열 쌍이 적혀 있습니다. 마우스용 여섯, 사람용 넷이에요.

유전자	종	왜 재나
Ddx54	마우스	넉다운이 됐나 — 이 논문의 핵심
cMYC	마우스·사람	DDX54 가 켜는 경로
Cd38 · Cd47	마우스·사람	면역회피 표지자
Gapdh · β-actin	마우스	기준 유전자 — 8강
GAPDH	사람	사람 세포(A549)용 기준

마우스용과 사람용이 따로 있는 것을 눈여겨보세요. 서열이 다르니 프라이머도 달라야 합니다.

High school프라이머 한 쌍이 하는 일

PCR은 두 개의 짧은 DNA 조각이 양쪽에서 붙어야 시작됩니다.

프라이머	붙는 곳
정방향 (forward)	증폭할 구간의 앞쪽
역방향 (reverse)	뒤쪽 — 반대 가닥에

두 프라이머 사이의 구간만 증폭됩니다 — 그 길이가 산물의 크기입니다.

High school좋은 프라이머의 조건

조건	기준	왜
길이	18~25 염기	짧으면 비특이, 길면 비효율
Tm	58~62°C · 두 프라이머가 비슷	같은 온도에서 붙어야
GC 함량	40~60%	결합 세기
3′ 말단	G나 C로 끝나면 좋음	연장 시작점이 단단히 붙음
자기끼리 안 붙기	이량체·헤어핀 없음	9강 — 가짜 산물
산물 길이	70~200 bp	qPCR에 적합

Gapdh 의 정방향 프라이머는 유난히 GC 가 낮습니다. Tm 이 어떻게 나올까요?

Python Runs in your browser

# Table S5 의 프라이머를 검산한다
프라이머 = [
    ("Ddx54",   "mouse", "ACATCCCACTGCTGGACAACGT",  "GCCACCAAAGAATAGGCTGTGC"),
    ("cMYC",    "mouse", "TCGCTGCTGTCCTCCGAGTCC",   "GGTTTGCCTCTTCTCCACAGAC"),
    ("Cd38",    "mouse", "AGAAGATGCCTGTGGTGTGG",    "GGTGCTCAGGGTTCTTCACA"),
    ("Cd47",    "mouse", "ATGCTTCTGGACTTGGCCTC",    "GCTCACATGCCATGATGCAG"),
    ("Gapdh",   "mouse", "CCTTCATTGACCTCAACTAC",    "GGAAGGCCATGCCAGTGAGC"),
    ("GAPDH",   "human", "TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG", "TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT"),
]

def gc(s):  return (s.count("G") + s.count("C")) / len(s) * 100
def tm(s):
    # 짧은 올리고의 어림식 (Wallace rule)
    if len(s) < 14:
        return 2 * (s.count("A") + s.count("T")) + 4 * (s.count("G") + s.count("C"))
    return 64.9 + 41 * (s.count("G") + s.count("C") - 16.4) / len(s)

print(f"{'유전자':<9}{'종':<7}{'방향':<5}{'길이':>5}{'GC%':>7}{'Tm':>7}")
print("-" * 46)
for 이름, 종, f, r in 프라이머:
    for 방향, s in (("F", f), ("R", r)):
        print(f"{이름:<9}{종:<7}{방향:<5}{len(s):>5}{gc(s):>6.0f}%{tm(s):>6.1f}°C")
    diff = abs(tm(f) - tm(r))
    표 = "OK" if diff < 5 else "Tm 차이가 크다"
    print(f"{'':<21}→ 두 프라이머의 Tm 차이 {diff:.1f}°C  {표}")
    print()

High schoolTm이 왜 중요한가

Tm은 프라이머의 절반이 떨어지는 온도입니다. PCR의 어닐링 온도를 이것으로 정해요.

어닐링 온도	결과
너무 낮음	비슷한 서열에도 붙음 — 비특이 증폭
적절 (Tm보다 3~5°C 낮게)	목표에만 붙음
너무 높음	안 붙음 — 증폭 실패

두 프라이머의 Tm이 크게 다르면 한쪽만 잘 붙습니다 — 그래서 맞춰 설계합니다.

High school표를 읽을 때 확인할 것

확인	왜
종 (mouse/human)	서열이 다름 — 종을 틀리면 안 붙음
유전자 이름	별칭 주의
서열 방향	5′→3′으로 적혀 있나
산물 크기	9강의 융해곡선·젤 확인에 필요
엑손 위치	6강 — 게놈 DNA를 피했나

논문에 프라이머 서열을 적는 것은 재현성의 최소 조건입니다.

🤔 Check yourself

정방향과 역방향 프라이머의 Tm 을 비슷하게 맞춰야 하는 이유는?