Lesson 13 of 20

인산화효소 억제제 — p-STAT3 를 보려면 필수

SI Table S4 의 p-JAK1 · p-JAK2 · p-STAT3 · p-p65

논문 Table S4 의 항체 목록을 보면 p- 로 시작하는 것이 넷 있습니다.

항체	무엇을 잡나	경로
anti-phospho-JAK1	인산화된 JAK1 만	Jak-Stat3
anti-phospho-JAK2	인산화된 JAK2 만	Jak-Stat3
anti-phospho-STAT3	인산화된 STAT3 만	Jak-Stat3
anti-phospho-p65	인산화된 p65 만	NF-κB

이 항체들은 인산기가 붙은 자리를 알아봅니다. 인산기가 떨어지면 못 잡아요.

그런데 세포를 터뜨리면 인산화효소를 떼는 효소(포스파타아제) 도 함께 풀려납니다. 가만두면 몇 분 만에 인산기를 떼어 버려요.

터뜨림 → 포스파타아제 풀림 → 인산기 소실 → p- 신호 사라짐

그래서 용해버퍼에 인산화효소 억제제를 넣습니다. 논문이 0.1% 를 넣은 이유입니다.

High schoolp-STAT3를 보려면 필수

단백질 이름 앞의 p-는 인산화(phosphorylated)를 뜻합니다. p-STAT3는 인산화된 STAT3예요.

	STAT3	p-STAT3
상태	대기	활성화
하는 일	세포질에 있음	핵으로 들어가 유전자를 켬

인산기 하나가 스위치입니다 — 총량이 아니라 인산화 비율이 활성을 나타냅니다.

High school인산기가 빨리 사라지는 이유

세포 안에는 인산기를 떼어 내는 효소(포스파타아제)가 많습니다. 세포를 터뜨리면 이 효소들이 풀려납니다.

시간	일어나는 일
세포를 터뜨림	포스파타아제 방출
몇 분 안에	인산기가 떨어져 나감
결과	p-STAT3 밴드가 사라지거나 약해짐

신호가 안 보이는 것이 실제로 없어서인지 떨어져 나가서인지 구분해야 합니다.

High school억제제와 작업 요령

대책	내용
포스파타아제 억제제	NaF · Na₃VO₄ 등 — 쓰기 직전에 넣음
프로테아제 억제제	단백질 자체가 잘리는 것을 막음
얼음 위에서	효소 활성을 낮춤
빠르게	세포를 긁자마자 처리
바로 얼리기	−80°C

억제제는 불안정합니다 — 미리 넣어 둔 완충액은 며칠 뒤에 효과가 없습니다.

반감기는 가정값입니다. 보려는 것은 '빠르다' 는 모양입니다.

Python Runs in your browser

# 인산기는 얼마나 빨리 떨어지나
import numpy as np, matplotlib.pyplot as plt

t = np.linspace(0, 30, 300)      # 분

def 남은인산(억제제):
    반감기 = 45.0 if 억제제 else 3.5      # 분
    return 100 * np.exp(-np.log(2) * t / 반감기)

plt.plot(t, 남은인산(True),  label="억제제 있음", lw=2.4)
plt.plot(t, 남은인산(False), label="억제제 없음", lw=2.4)
plt.axvspan(0, 10, color="tab:gray", alpha=.15, label="용해~원심분리에 걸리는 시간")
plt.xlabel("세포를 터뜨린 뒤 시간 (분)"); plt.ylabel("남은 인산화 신호 (%)")
plt.legend(); plt.grid(alpha=.3); plt.show()

print(f"{'시간':>6}{'억제제 있음':>13}{'억제제 없음':>13}")
print("-" * 34)
for m in (2, 5, 10, 20, 30):
    i = np.argmin(abs(t - m))
    print(f"{m:>5}분{남은인산(True)[i]:>12.0f}%{남은인산(False)[i]:>12.0f}%")

print()
print("억제제가 없으면 10분 만에 p- 신호가 거의 사라집니다.")
print("'인산화가 줄었다' 는 결론이 사실은 '늦게 처리했다' 일 수 있어요.")

High school총 단백질과 함께 봐야 한다

p-STAT3만 보면 안 됩니다. 총 STAT3도 같이 봐야 해요.

관찰	해석
p-STAT3 ↓, 총 STAT3 그대로	활성화가 줄었다 — 원하는 결과
p-STAT3 ↓, 총 STAT3도 ↓	단백질 자체가 줄었을 뿐
p/총 비율	활성화 정도의 지표

SI Table S4에 p-JAK1·p-JAK2·p-STAT3·p-p65가 있는 것은 경로 전체를 보려는 것입니다.

🤔 Check yourself

웨스턴블롯에서 p-STAT3 와 총 STAT3 를 함께 보는 이유는?