Lesson 9 of 20

융해곡선 — 봉우리가 둘이면 무엇이 잘못됐나

SYBR 을 쓸 때 반드시 함께 보는 것

PCR 이 끝나면 기기가 온도를 천천히 올립니다. 60 °C 에서 95 °C 까지, 0.3 °C 씩.

DNA 이중가닥은 어느 온도에서 풀립니다. 풀리면 SYBR 이 떨어져 나가 형광이 뚝 떨어집니다.

그 떨어지는 지점을 미분하면 봉우리가 나옵니다. 이것이 융해곡선(melt curve)이에요.

봉우리 하나 = 산물 하나

봉우리 하나 · 날카로움

원하는 산물만 증폭됐다
Ct 값을 믿어도 된다

봉우리 둘 이상

비특이 증폭 또는 프라이머 이합체
Ct 에 엉뚱한 것이 섞여 있다

High school봉우리가 둘이면

PCR이 끝난 뒤 온도를 천천히 올립니다. 이중가닥이 풀리면서 SYBR이 떨어지고 형광이 줄어요.

관찰	뜻
봉우리 하나	산물이 한 종류 — 정상
봉우리 둘 이상	산물이 여럿 — 문제
낮은 온도에 작은 봉우리	프라이머 이량체

산물마다 Tm이 다릅니다 — 길이와 GC 함량에 따라요.

봉우리 위치가 알려 주는 것

DNA 가 풀리는 온도(Tm)는 길이와 GC 함량으로 정해집니다.

봉우리 위치	무엇일 가능성
낮다 (70~78 °C)	프라이머 이합체 — 짧고 AT 가 많다
알맞다 (80~88 °C)	원하는 산물
높다 (88 °C 이상)	더 긴 산물 — 게놈 DNA 유래일 수 있다 (7강)

7강에서 설계한 '인트론을 사이에 둔' 프라이머를 기억하세요. 게놈 DNA 에서 나온 산물은 인트론만큼 길어서 Tm 이 높습니다 — 융해곡선에서 바로 보입니다.

High school무엇이 잘못됐나

추가 봉우리	원인	대처
낮은 Tm (65~75°C)	프라이머 이량체	프라이머 재설계 · 농도 낮추기
비슷한 Tm	비특이 증폭	어닐링 온도 올리기
훨씬 높은 Tm	게놈 DNA 산물 (인트론 포함)	6강 — DNase 처리

7강에서 설계한 '인트론을 사이에 둔' 프라이머를 기억하세요 — 게놈 산물은 더 길고 Tm이 높습니다.

High school프라이머 이량체가 왜 생기나

프라이머끼리 3′ 끝이 서로 상보적이면 붙어서 서로를 연장합니다.

조건	이량체 위험
주형이 적을 때	높음 — 프라이머끼리 만날 확률 증가
프라이머 농도가 높을 때	높음
낮은 온도에서 오래	높음

NTC(주형 없음)에서 특히 잘 생깁니다 — 그래서 NTC의 융해곡선을 꼭 봅니다.

산물의 양(a 값)을 바꿔 보세요. 작은 봉우리도 보일까요?

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# 융해곡선을 그려 본다 — 봉우리가 곧 산물
import numpy as np, matplotlib.pyplot as plt

T = np.linspace(65, 95, 400)

def 풀림(Tm, 폭=1.2, 양=1.0):
    # S 자로 풀리는 곡선
    return 양 / (1 + np.exp((T - Tm) / 폭))

경우 = {
    "깨끗함 (산물 하나)":      [(84.0, 1.0)],
    "프라이머 이합체가 섞임":   [(84.0, 1.0), (74.5, 0.35)],
    "게놈 DNA 산물이 섞임":     [(84.0, 1.0), (89.5, 0.45)],
}

fig, ax = plt.subplots(1, 2, figsize=(11, 4))
for 이름, 산물들 in 경우.items():
    형광 = sum(풀림(tm, 양=a) for tm, a in 산물들)
    미분 = -np.gradient(형광, T)
    ax[0].plot(T, 형광 / 형광.max(), label=이름)
    ax[1].plot(T, 미분 / 미분.max(), label=이름)

ax[0].set_title("형광 (온도를 올리며)"); ax[0].set_ylabel("형광 (정규화)")
ax[1].set_title("미분 — 봉우리가 곧 산물"); ax[1].set_ylabel("-d(형광)/dT")
for a in ax: a.set_xlabel("온도 (°C)"); a.legend(fontsize=7); a.grid(alpha=.3)
plt.tight_layout(); plt.show()

print("봉우리 개수를 세는 것이 전부입니다.")
print("하나면 깨끗하고, 둘 이상이면 Ct 에 엉뚱한 것이 섞여 있습니다.")

High school융해곡선을 안 보면

일어나는 일	결과
이량체 신호를 목표 산물로 셈	발현이 있는 것처럼 보임
비특이 산물이 섞임	Ct가 실제보다 낮음
게놈 DNA 산물	가짜 발현

SYBR을 쓰면서 융해곡선을 안 보고 보고하는 것은 근거가 불완전합니다.

논문에서 SYBR을 썼다고 하면, 융해곡선을 확인했는지 보는 것이 좋은 습관이에요.

🤔 Check yourself

융해곡선에서 74 °C 근처에 작은 봉우리가 하나 더 보입니다. 가장 흔한 원인은?