17강 / 20강

로딩대조군 GAPDH — 없으면 어떤 주장이 무너지나

SI Table S4 「anti-GAPDH, Cell signaling 5174」

웨스턴블롯에서 CD47 밴드가 옅어졌습니다. "CD47 이 줄었다" 고 말해도 될까요?

아직 안 됩니다. 두 가지 가능성이 있어요.

진짜로 줄었다

CD47 단백질이 실제로 감소

적게 올렸다

그 레인에 시료를 적게 넣었다
또는 전사가 덜 됐다

가르는 방법은 어느 세포에나 비슷하게 있는 단백질을 함께 잡는 것입니다. 그것이 로딩대조군이에요.

CD47 밴드 세기 ÷ GAPDH 밴드 세기

적게 올렸다면 GAPDH 도 함께 옅어집니다. 나누면 상쇄되죠. qPCR 의 기준 유전자(11강)와 같은 생각입니다.

고등학생없으면 어떤 주장이 무너지나

웨스턴블롯에서 밴드가 약해졌다고 합시다. 두 가지가 가능해요.

가능성	내용
단백질이 실제로 줄었다	원하는 결론
시료를 적게 넣었다	기술적 문제

로딩 대조군이 없으면 이 둘을 구분할 수 없습니다.

고등학생로딩 대조군의 조건

조건	왜
실험 조건에서 안 변함	기준이 되려면
발현이 충분히 높음	안정적으로 검출
목표 단백질과 크기가 다름	같은 막에서 구분되게
포화되지 않음	18강 — 정량이 되려면

GAPDH·β-actin·튜불린이 흔히 쓰입니다 — 10강의 qPCR 기준 유전자와 같은 논리입니다.

로딩대조군 없이 위 결과를 보면 어떤 결론을 내리게 될까요?

Python 브라우저에서 실행

# 로딩대조군이 있고 없고 — 결론이 뒤집힐 수 있다
밴드 = {
    #        CD47   GAPDH
    "대조":  (100.0, 100.0),
    "KD-A": ( 62.0,  98.0),     # 진짜로 줄었다
    "KD-B": ( 61.0,  60.0),     # 시료를 적게 올렸을 뿐이다
}

print(f"{'레인':<8}{'CD47':>8}{'GAPDH':>8}{'보정 전':>10}{'보정 후':>10}  판정")
print("-" * 60)
기준 = 밴드["대조"]
for 이름, (cd47, gapdh) in 밴드.items():
    보정전 = cd47 / 기준[0]
    보정후 = (cd47 / gapdh) / (기준[0] / 기준[1])
    판정 = "정말 줄었다" if 보정후 < 0.8 else "로딩 차이였다"
    print(f"{이름:<8}{cd47:>8.0f}{gapdh:>8.0f}{보정전:>10.2f}{보정후:>10.2f}  {판정}")

print()
print("보정 전만 보면 KD-A 와 KD-B 가 똑같이 '줄어든' 것처럼 보입니다.")
print("GAPDH 로 나누면 KD-B 는 그냥 적게 올린 것이었음이 드러납니다.")

고등학생로딩 대조군도 변할 수 있다

변하는 상황	내용
저산소·대사 변화	GAPDH 증가
세포골격 재편	액틴 변화
세포 사멸	전반적 감소
세포 유형이 다름	기준 발현량이 다름

대조군이 군마다 다르면 모든 정량이 틀어집니다.

그래서 요즘은 총 단백질 염색(Ponceau, stain-free 젤)을 로딩 대조로 쓰기도 합니다. 특정 단백질에 의존하지 않으니까요.

고등학생같은 막에서 봐야 한다

방법	신뢰도
같은 막을 재탐침 (stripping)	좋음 — 같은 시료·같은 전사
같은 막의 다른 크기 구역	가장 좋음 — 벗길 필요 없음
다른 젤을 따로 돌림	약함 — 전사 효율이 다를 수 있음

"별도 젤에서 얻은 로딩 대조"는 같은 조건이라는 보장이 없습니다.

19강의 전체 블롯 그림이 이것을 확인하게 해 줍니다 — 어느 밴드가 같은 막에서 왔는지 보여요.

🤔 확인 문제

웨스턴블롯에서 로딩대조군이 없으면 말할 수 없게 되는 것은?