유박사의 시퀀싱 라이브러리 첫걸음

FASTQ 는
하늘에서 떨어지지 않는다

네 건식 강의는 모두 파일 하나에서 시작합니다. 그런데 그 파일이 어디서 왔는지는 다루지 않아요.
이 20강이 그 빈자리를 채웁니다 — 그리고 라이브러리를 만들 때 정한 것들이 분석으로는 되돌릴 수 없는 제약이 된다는 것까지.

📦 라이브러리🏷️ 인덱스·UMI🔬 10x GEM 🗺️ Xenium🇰🇷 한국어

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이렇게 배웁니다

📄논문의 한 줄에서 시작

모든 강이 논문 부록의 방법 문단 한 줄을 펼친 것입니다. 강마다 어느 대목인지 부제에 적어 두었습니다.

▶️숫자를 직접 굴려 보기

계산과 곡선을 전부 브라우저 안에서 손으로 굴려 봅니다. 설치할 것이 없습니다.

🎛️다르게 정해 보기

값을 바꿔 보면 결론이 어디서 흔들리는지 보입니다. 위젯이 그것을 위해 있습니다.

⚖️말할 수 있는 것까지만

마지막 강은 이 실험으로 말할 수 있는 것과 말할 수 없는 것을 갈라 놓습니다.

전체 커리큘럼

FASTQ 는 하늘에서 떨어지지 않는다

논문이 만든 네 가지 라이브러리 · 이 20강의 지도

시퀀서가 읽을 수 있는 모양 — 라이브러리란 무엇인가

왜 RNA 를 그대로 넣을 수 없나

RNA 품질 — RIN 과 DV200

SI 「RNA quality was assessed by Agilent 2100 bioanalyzer」·「DV200 assessment (threshold 30%)」

네 가지를 견준다 — 무엇을 알고 싶으냐가 방법을 정한다

bulk · small RNA · 10x · Xenium

어댑터를 붙인다 — 결찰이라는 이어 붙이기

SI 「total RNA from each sample was used to ligate the adaptors」

인덱스 — 여러 시료를 한 레인에 섞어 넣기

SI 「After pooled libraries were denatured」

클러스터 — 한 조각을 수천 개로 불려 밝게 만든다

SI 「TruSeq Rapid PE Cluster Kit and TruSeq Rapid SBS Kit」

SBS — 한 글자씩 붙이며 사진을 찍는다

SI 「TruSeq Rapid SBS Kit」 · 왜 뒤로 갈수록 부정확해지나

100 bp 페어드엔드 — 읽기 길이와 방향을 정한다

SI 「the 100 bp paired-end mode ... with HiSeq 2500」

【실습】 FASTQ 한 레코드를 뜯어본다

네 줄에 무엇이 들어 있나 · 어댑터가 보이는 자리

QuantSeq 3′ — 왜 끝만 읽나

SI 「RNA from samples was isolated and subjected to QuantSeq 3' mRNA-Seq」

PAGE 크기선별 — 어댑터 이합체를 잘라 버린다

SI 「libraries were cleaned up using QIAquick PCR Purification Kit and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gel」

10x GEM — 기름방울 하나에 세포 하나

SI 「A library for single-cell RNA sequencing was constructed using the 10x Genomics 5' kit」

UMI — PCR 이 만든 사본을 세지 않는다

분자마다 다른 무작위 꼬리표

【실습】 세포를 몇 개 넣을까 — 이중체율의 계산

논문 Fig. S15 · QC 뒤 29,343 세포

Xenium — 자르지 않고 조직 안에서 읽는다

SI 「The Xenium In Situ Gene Expression assay (Cat# 1000672)」

Xenium 절차 열한 단계 — 절편에서 이미지까지

SI Xenium 문단 · 5 µm · 42 °C · DV200 · 자가형광 소광

전사체 수를 읽는다 — 네 조건의 숫자가 말하는 것

SI 「(1) WT+isotype 198,792 ... (4) KD+anti-PD1 217,301 transcripts」

파이프라인 — FASTQ 다음에 무엇이 오나

SI 「Trimmomatic – STAR – HTSeq」·「CellRanger v6.1.0」·「Xenium Explorer」

넘기기 — 네 라이브러리가 네 강의로

이 20강이 끝나는 자리 · 말할 수 있는 것과 없는 것