6강 / 20강

인덱스 — 여러 시료를 한 레인에 섞어 넣기

SI 「After pooled libraries were denatured」

시퀀서 한 번 돌리는 데 수백만 원이 듭니다. 그런데 시료 하나에 그만한 읽기가 필요하지는 않아요.

그래서 여러 시료를 섞어 한 번에 읽습니다. 이것이 풀링(pooling) 이에요.

섞어 읽고 나서 어떻게 갈라낼까요? 인덱스가 답합니다.

시료 A → [P5]-[ATCACG]-...내 서열...-[P7]
시료 B → [P5]-[CGATGT]-...내 서열...-[P7]
시료 C → [P5]-[TTAGGC]-...내 서열...-[P7]
                  ↓ 섞어서 한 레인에 넣는다
                  ↓ 읽고 나서 인덱스로 갈라낸다 (demultiplexing)
시료 A · 시료 B · 시료 C 의 FASTQ 세 파일

논문이 pooled libraries were denatured 라고 적은 것이 이 과정입니다.

고등학생여러 시료를 한 레인에

시퀀서 한 번에 시료 하나만 넣으면 낭비입니다. 여럿을 섞어 넣어요.

단계	내용
1	시료마다 다른 인덱스 서열을 어댑터에 넣음
2	농도를 맞춰 섞음 (풀링)
3	한 번에 시퀀싱
4	인덱스로 다시 나눔

인덱스는 시료의 이름표입니다 — 6~10 염기짜리요.

고등학생농도를 맞추는 것이 중요하다

농도가 안 맞으면	결과
어떤 시료가 진함	그 시료가 read를 많이 차지
어떤 시료가 묽음	read가 부족 — 깊이 미달

균등하게 섞으려면 정확한 정량이 필요합니다 — Qubit이나 qPCR로요.

qPCR 정량이 가장 정확합니다. 클러스터를 만들 수 있는 온전한 라이브러리만 세니까요.

시료 D 를 빼면 최소 거리가 얼마가 될까요?

Python 브라우저에서 실행

# 인덱스는 서로 충분히 달라야 한다 — 해밍 거리
인덱스 = {
    "ATCACG": "시료 A",
    "CGATGT": "시료 B",
    "TTAGGC": "시료 C",
    "ATCACT": "시료 D (A 와 한 글자 차이)",
}

def 해밍(a, b):
    return sum(x != y for x, y in zip(a, b))

이름 = list(인덱스)
print("인덱스끼리의 해밍 거리 (다른 글자 수)")
print(f"{'':>9}" + "".join(f"{k:>9}" for k in 이름))
for a in 이름:
    print(f"{a:>9}" + "".join(f"{해밍(a,b):>9}" for b in 이름))

print()
최소 = min(해밍(a, b) for i, a in enumerate(이름) for b in 이름[i+1:])
print(f"가장 가까운 두 인덱스의 거리: {최소}")
print()
if 최소 >= 3:
    print("거리가 3 이상이면 읽기 오류가 한 글자 나도 올바른 시료로 되돌릴 수 있습니다.")
else:
    print(f"⛔ 거리가 {최소} 뿐입니다.")
    print("   시퀀싱 오류가 한 글자만 나도 다른 시료로 잘못 배정됩니다 (index hopping).")
    print("   → 시료 D 를 빼고 거리가 먼 인덱스로 바꿔야 합니다.")

고등학생인덱스 서열을 고르는 규칙

규칙	왜
서로 여러 글자 다르게	한 글자 오류를 고칠 수 있게
염기 조성이 균형	각 사이클에 ACGT가 고루
제조사 권장 조합	위 두 가지를 이미 고려

두 번째 줄이 중요합니다 — 모든 시료의 인덱스 첫 글자가 A면 기계가 판독을 못 합니다.

고등학생인덱스 호핑

섞어 놓으면 인덱스가 바뀌는 일이 생깁니다.

원인	대처
자유 어댑터가 남음	철저한 정제
패턴화 플로우셀 화학	고유 이중 인덱스 (UDI)

UDI를 쓰면 조합이 안 맞는 read를 걸러 낼 수 있습니다.

비율은 0.1~2% 정도예요. 발현 정량에는 큰 문제가 아니지만, 드문 변이를 볼 때는 치명적입니다.

🤔 확인 문제

여러 시료를 한 레인에 섞어 읽을 수 있게 해 주는 것은?