9강 / 20강

100 bp 페어드엔드 — 읽기 길이와 방향을 정한다

SI 「the 100 bp paired-end mode ... with HiSeq 2500」

논문의 bulk RNA-seq 설정입니다.

sequencing of each library was carried out using the 100 bp paired-end mode
of the TruSeq Rapid PE Cluster Kit and TruSeq Rapid SBS Kit with HiSeq 2500

두 가지가 정해져 있습니다 — 100 bp 와 paired-end.

단일말단 (single-end)

한쪽에서만 읽는다

싸고 빠르다
miRNA 처럼 인서트가 짧으면 충분

페어드엔드 (paired-end)

양쪽에서 하나씩, 마주 보게

두 배 비싸다
정렬이 정확하고 스플라이싱·구조 변이를 본다

논문은 bulk 에 페어드엔드, small RNA 에 단일말단 75 를 썼습니다. 왜 다를까요?

고등학생읽기 길이와 방향을 정한다

"100 bp paired-end"는 두 가지를 뜻합니다.

항목	뜻
100 bp	한쪽에서 100 염기를 읽음
paired-end	양쪽 끝에서 각각 읽음

삽입물이 300 bp면 양 끝 100씩을 읽고 가운데 100은 안 읽습니다.

인서트보다 길게 읽으면 어댑터가 나온다

miRNA 는 약 22 nt 입니다. 그런데 75 글자를 읽으면?

읽기 (75 nt)
 ├─ miRNA 22 nt ─┤├────── 어댑터 서열 53 nt ──────┤
 UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCC...

22글자를 지나면 어댑터를 읽기 시작합니다. 그래서 miRNA 시퀀싱에서는 어댑터 잘라내기(trimming) 가 필수예요.

거꾸로 이 성질을 이용하면 인서트 길이를 알 수 있습니다 — 어댑터가 시작되는 자리가 곧 인서트의 끝이니까요.

miRNA 는 어차피 22 nt 라 한쪽만 읽어도 다 읽습니다. 그래서 페어드엔드가 필요 없어요.

고등학생양말단이 주는 것

이점	내용
정렬 정확도	한쪽이 애매해도 짝이 위치를 정함
삽입물 길이 정보	두 read 사이 거리를 앎
스플라이싱 검출	엑손 두 개에 걸친 쌍
구조 변이	짝의 거리가 이상하면 신호

단일말단은 싸지만 이 정보를 다 잃습니다.

고등학생길이를 어떻게 정하나

목적	권장
발현 정량만	50 bp 단일말단이면 충분
일반 RNA-seq	100 bp 양말단
스플라이싱·변이	150 bp 양말단
small RNA	짧게 — 삽입물이 20 염기

마지막 줄이 중요합니다 — small RNA를 100 bp로 읽으면 대부분이 어댑터입니다.

읽기 길이를 22로 줄이면 어댑터가 안 나옵니다 — 그런데 왜 그렇게 하지 않을까요?

Python 브라우저에서 실행

# 읽기 길이가 인서트보다 길면 어댑터가 읽힌다
miRNA   = "TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT"          # 22 nt (let-7a)
어댑터   = "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCG"

for 읽기길이 in (22, 35, 50, 75):
    읽은것 = (miRNA + 어댑터)[:읽기길이]
    어댑터몫 = max(0, 읽기길이 - len(miRNA))
    print(f"[{읽기길이} nt 를 읽으면]")
    print(f"  {읽은것}")
    print(f"  {'^' * min(읽기길이, len(miRNA))}{'~' * 어댑터몫}")
    print(f"  ^ = miRNA {min(읽기길이, len(miRNA))} nt   ~ = 어댑터 {어댑터몫} nt "
          f"({어댑터몫/읽기길이:.0%})")
    print()

print("논문은 small RNA 에 single-end 75 를 썼습니다.")
print("22 nt 를 읽고 나면 나머지 53 nt 는 전부 어댑터입니다 —")
print("그래서 파이프라인의 첫 단계가 어댑터 잘라내기예요.")
print()
print("거꾸로: 어댑터가 시작되는 자리를 찾으면 인서트 길이를 알 수 있습니다.")

고등학생길이와 비용

선택	비용
2×150	가장 비쌈
2×100	중간
1×50	가장 쌈

사이클 수가 비용을 정합니다 — 2×150이면 300 사이클입니다.

같은 예산으로 짧게 읽으면 더 많은 read를 얻을 수 있어요. 발현 정량에는 그 편이 유리합니다.

🤔 확인 문제

논문이 small RNA 시퀀싱에 페어드엔드를 쓰지 않은 이유는?