11. poly(A) 꼬리 — 150 염기 이상, 그리고 낚싯바늘 · 유박사의 mRNA 즉석 합성기 첫걸음 I

전사가 끝난 mRNA 의 3′ 끝에 A 를 줄줄이 붙입니다. 조건은 이렇습니다.

E-PAP (대장균 poly(A) 중합효소)  40 U
5× E-PAP 완충액
MnCl₂  2.5 mM
ATP    1 mM
전체 400 µL,  37 °C 1 시간
→ 150 염기 이상의 꼬리

꼬리가 하는 일도 캡처럼 여럿입니다.

⏳

수명

3′ 쪽에서 갉아 들어오는 효소가 꼬리부터 먹습니다. 꼬리가 길수록 오래 삽니다

🔁

번역 되먹임

PABP 가 꼬리에 붙고 캡과 손을 잡아 mRNA 가 고리가 됩니다. 리보솜이 잘 돕니다

🎣

낚싯바늘

다음 걸음(12강)이 oligo d(T) 로 이 꼬리를 낚습니다

효소 양과 시간을 밀어 보세요. 꼬리 길이가 하나의 값이 아니라 분포라는 것이 보입니다.

불러오는 중…

꼬리 길이는 분포입니다. 이 사실이 다음 강의 정제 회수율을 정합니다.

Python 브라우저에서 실행

# 효소로 붙이는 꼬리는 길이가 고르지 않다. 대략 포아송을 닮은 분포가 된다.
import numpy as np

rng = np.random.default_rng(7)
mean_len = 200          # 평균 200 염기라고 하자

lens = rng.poisson(mean_len, size=20000)
print("평균 %.0f · 표준편차 %.0f" % (lens.mean(), lens.std()))
print("가장 짧은 것 %d, 가장 긴 것 %d" % (lens.min(), lens.max()))
print()
for thr in (100, 150, 200, 250):
    print("꼬리 %3d 염기 이상인 비율: %5.1f%%" % (thr, (lens >= thr).mean() * 100))
print()
print("→ '150 염기 이상' 은 분포의 이름이지 모든 분자의 성질이 아니다.")
print("   짧은 꼬리를 가진 분자는 oligo d(T) 에 약하게 붙어 세척에서 씻겨 나간다.")

꼬리를 붙이고 나면 부피가 두 배가 된다

작지만 공정에서 중요한 사실 하나. IVT 는 200 µL 였는데 꼬리 반응은 400 µL 입니다. E-PAP 완충액과 ATP 를 더 부었기 때문입니다.

200 µL → 400 µL → 정제 뒤 200 µL

부피가 늘었다 줄었다 합니다. 상자 안의 배관과 저장통 크기는 이 최대 부피에 맞춰 설계해야 합니다. 자동화 장치에서 “부피 계획” 은 화학만큼이나 실무적인 제약입니다.

🤔 확인 문제

poly(A) 꼬리가 이 공정에서 두 몫을 한다는 것은 무슨 뜻인가요?

🤔 확인 문제

효소로 붙인 꼬리가 주형에 새긴 꼬리보다 나쁠 수 있는 점은?