4. PCR — 4.8 ng 을 불린다 · 유박사의 mRNA 즉석 합성기 첫걸음 I

논문의 PCR 조건을 그대로 옮기면 이렇습니다.

무엇	얼마
LA Taq 중합효소	10 U
dNTP 혼합	각 200 nM
DNA 주형	4.8 ng
프라이머 F · R	각 200 nM
전체 부피	200 µL

95 °C  5 min                      ← 처음 한 번 풀어 준다
[ 95 °C 40 s → 58 °C 45 s → 72 °C 60 s ] × 30
72 °C 10 min                      ← 끝을 마저 채운다

4.8 ng 에서 시작합니다. 손톱에 얹으면 보이지도 않는 양입니다.

사이클 수와 효율을 밀어 보세요. 이론값과 바닥(plateau) 이 어디서 갈라지는지 보입니다.

불러오는 중…

지수는 무한히 가지 않습니다. 재료가 유한하기 때문입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 이론상 2^30 = 10.7억 배. 실제로는 왜 그렇게 안 되나.
import numpy as np

start_ng = 4.8
cycles   = 30

for eff in (1.00, 0.95, 0.85, 0.70):
    fold = (1 + eff) ** cycles
    print("효율 %3.0f%% → %10.3e 배   %12.1f µg" % (eff * 100, fold, start_ng * fold / 1000))

print()
# 진짜 한계는 효율이 아니라 '재료'다. dNTP 200 nM × 4 × 200 µL 로 만들 수 있는 DNA 질량.
dNTP_nmol = 200e-9 * 200e-6 * 1e9 * 4      # nmol, 네 가지 합
mw_nt     = 330.0                          # g/mol
max_ug    = dNTP_nmol * 1e-9 * mw_nt * 1e6
max_ng    = max_ug * 1000
print("dNTP 를 남김없이 다 써도 만들 수 있는 DNA:  %.1f ng  (= %.4f µg)" % (max_ng, max_ug))
fold = max_ng / start_ng
hit  = int(np.ceil(np.log(fold) / np.log(1.85)))
print("주형 4.8 ng 의 %.0f 배뿐이다 — 효율 85%% 라면 %d 사이클 언저리에서 바닥난다." % (fold, hit))
print()
print("주의: 논문 표기가 '각 200 nM' 이다. 통상 PCR 처방은 각 200 µM 이고,")
print("그러면 천장이 52.8 µg 로 1000배 커진다. 어느 쪽인지는 /reag 7강에서 따진다.")

Fig. 3c 가 실제로 증명한 것

논문은 이 상자의 PCR 산물과 상용 PCR 기계(Bio-Rad T100) 의 산물을 같은 젤에 나란히 올렸습니다. 띠의 위치가 같고 진하기가 비슷했습니다.

📏

띠의 위치

길이가 맞다 — 엉뚱한 것을 불리지 않았다

🔦

띠의 진하기

양이 비슷하다 — 효율이 크게 떨어지지 않았다

🚫

다른 띠 없음

비특이 산물이 적다 — 온도 제어가 제 몫을 했다

젤 사진 한 장이 재는 것은 여기까지입니다. 서열이 맞는지는 젤이 말해 주지 않습니다. 이 상자는 산물의 서열을 확인하지 않았습니다.

🤔 확인 문제

PCR 을 30 사이클에서 멈추는 가장 큰 까닭은?

🤔 확인 문제

Fig. 3c 의 젤 사진이 보여 주지 못하는 것은?