Lesson 17 of 20

Phase II — 용의자를 실제로 꺼 본다

프로토콜 Phase II · shRNA · CRISPR · 퓨로마이신 · qRT-PCR · Western

16강까지는 전부 계산이었습니다. 계산은 상관을 말할 수 있을 뿐 인과를 증명하지 못합니다. "DDX54 가 높은 종양에서 면역세포가 적다" 는 것과 "DDX54 때문에 면역세포가 못 온다" 는 전혀 다른 주장입니다.

인과를 증명하는 방법은 하나뿐입니다. 그것만 바꾸고 나머지는 그대로 두는 것. 전등 스위치가 어느 방의 불을 켜는지 알고 싶으면 스위치를 내려 보면 됩니다.

끄는 두 가지 방법

녹다운 (KD) — shRNA · siRNA

DNA 는 그대로 두고 mRNA 를 분해합니다.
발현이 보통 60~90% 로 줄어듭니다.

부분적으로 끈다 · 되돌릴 수 있다 · 약물과 비슷한 상황

녹아웃 (KO) — CRISPR/Cas9

DNA 자체를 잘라 유전자를 못 쓰게 만듭니다.
단백질이 아예 안 만들어집니다.

완전히 끈다 · 되돌릴 수 없다 · 유전학적으로 깔끔

논문은 둘 다 했습니다. KD 로 "약을 쓴 것 같은" 상황을 만들고, KO 로 "완전히 없앤" 상황을 만들어 결론이 같은지 확인했습니다. 방법이 달라도 같은 결과가 나오면 방법의 부작용이 아니라 유전자의 효과라고 말할 수 있습니다.

High school용의자를 실제로 꺼 본다

16강까지는 전부 계산 이었다.

계산은 상관을 말할 수 있을 뿐 인과를 증명하지 못한다

계산이 말하는 것	실험이 말하는 것
연관이 있다	끄면 바뀐다
후보다	원인이다

끄고 결과를 보는 것 — 그것이 인과의 표준 증명이다

프로토콜 Phase II-1 · 도입 (Transfection / Transduction)

단계	실제로 하는 일
shRNA 벡터 준비	Ddx54 를 겨눈 짧은 머리핀 RNA 서열을 플라스미드에 넣는다 논문 서열: CCGGTTTATCAGCAGCTCTTA
렌티바이러스 포장	HEK293T 세포에 shRNA 벡터 + 포장 플라스미드(pLP1·pLP2·VSVG)를 함께 넣어 바이러스 입자를 만들게 한다
형질도입	그 바이러스로 LLC1 폐암세포를 감염시킨다 (폴리브렌 8 µg/mL 로 효율을 높인다)
CRISPR 쪽	Cas9 + Ddx54 겨냥 gRNA 두 개를 담은 렌티바이러스 벡터를 쓴다 gRNA: GCAGAATGTCGTTCGGCCCC · CGTTGTTGGCCACGCGGTGC

프로토콜 Phase II-2 · 선별과 검증

바이러스가 모든 세포에 들어가지는 않습니다. 그래서 벡터에 항생제 저항 유전자를 함께 넣어 두고, 퓨로마이신 3 µg/mL 을 뿌립니다. 벡터가 안 들어간 세포는 죽고 들어간 세포만 살아남죠. 아주 단순하고 확실한 선별법입니다.

선별이 끝나면 정말 꺼졌는지 두 층위에서 확인합니다.

🧬

qRT-PCR

mRNA 가 줄었는가 — 전사 수준

🥩

Western blot

단백질이 줄었는가 — 번역 수준

둘 다 확인하는 이유는, mRNA 가 줄었어도 단백질이 오래 남아 있으면 표현형이 안 바뀔 수 있기 때문입니다.

High school어떻게 끄나

방법	내용	정도
shRNA	RNA 를 분해	부분적 (70~90%)
CRISPR	유전자를 잘라냄	완전

둘 다 하는 이유

방법마다 오프타깃 이 다르다.

두 방법이 같은 결과 를 주면 오프타깃 탓이 아니라는 증거다.

그리고 확인이 필요하다

확인	방법
RNA 가 줄었나	qRT-PCR
단백질이 줄었나	Western

껐다고 주장하려면 실제로 꺼졌는지 두 층에서 확인해야 한다

RNA-seq 은 qRT-PCR 과 같은 것을 봅니다 — 대상 유전자의 mRNA 가 실제로 줄었는가.

Python Runs in your browser

import gene

# GSE285342 — 논문의 LLC1 실험 원자료.  WT(대조) 4개 vs Ddx54 KD 3개
L = gene.mouse_logcpm()
print("생쥐 실험 자료:", L.shape, "(유전자 × 샘플)")
print("샘플:", list(L.columns))
print()

# 검증 1 — 정말 꺼졌는가
wt = L.loc["Ddx54", gene.MWT]
kd = L.loc["Ddx54", gene.MKD]
print("Ddx54 발현 (log2 CPM)")
print("  대조군 WT :", [round(v, 2) for v in wt], " 평균", round(wt.mean(), 2))
print("  녹다운 KD :", [round(v, 2) for v in kd], " 평균", round(kd.mean(), 2))
print()
diff = kd.mean() - wt.mean()
print(f"  log2 차이 : {diff:+.3f}   →  {2**diff*100:.0f}% 로 줄었다 (약 {(1-2**diff)*100:.0f}% 감소)")

de = gene.mouse_de()
print(f"  p값 : {de.loc['Ddx54','p']:.2e}")
print()
print("녹다운은 '완전히 끄는 것'이 아닙니다 — 이 정도가 shRNA 의 전형적인 수준입니다.")

대조군이 서로 비슷하고, 실험군이 서로 비슷하고, 두 무리가 갈라져 있어야 합니다.

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import gene

# 검증 2 — 대조군끼리는 서로 비슷한가 (실험이 안정적인가)
L = gene.mouse_logcpm()
wt = L[gene.MWT]; kd = L[gene.MKD]

print("그룹 안의 흩어짐 vs 그룹 사이의 차이 — Ddx54")
w = L.loc["Ddx54", gene.MWT]; k = L.loc["Ddx54", gene.MKD]
print(f"  WT 안의 표준편차 : {w.std():.3f}")
print(f"  KD 안의 표준편차 : {k.std():.3f}")
print(f"  두 그룹 평균 차이 : {abs(k.mean()-w.mean()):.3f}")
print("  → 그룹 사이 차이가 그룹 안 흩어짐보다 훨씬 큽니다. 좋은 실험입니다.")
print()

# 전체 유전자로 보면 — 샘플끼리 얼마나 닮았나
import numpy as np
C = np.corrcoef(L.values.T)
print("샘플 간 상관 (전체 유전자 기준)")
names = list(L.columns)
print("        " + "".join(f"{n[:6]:>8}" for n in names))
for i, n in enumerate(names):
    print(f"{n[:6]:>8}" + "".join(f"{C[i,j]:>8.3f}" for j in range(len(names))))
print()
print("같은 그룹끼리 더 닮아 있으면 실험이 잘된 것입니다.")

High school퓨로마이신 선별

shRNA 벡터에는 항생제 저항 유전자 가 함께 들어 있다.

단계	하는 일
1	벡터를 세포에 넣음
2	퓨로마이신 을 넣음
3	벡터가 안 들어간 세포는 죽음
4	남은 세포는 전부 벡터를 가짐

왜 필요한가

벡터가 모든 세포에 들어가지 않는다. 그러면 섞인 집단 이 된다.

선별하면 순수한 집단 이 된다.

실험군이 순수해야 그 실험군에서 관찰한 것을 그 처리 때문이라 말할 수 있다

🎮 녹다운 검증 실험실

shRNA 와 CRISPR 을 골라 보고, 퓨로마이신 선별을 켜고 꺼 보세요. 그리고 대조군 없이 실험군만 봤을 때 어떤 오판이 생기는지 확인해 보세요.

High school무엇을 확인할 것인가

확인	기대
표적 유전자 발현	줄었나
레귤론 표적들	예측대로 변했나
CD38 · CD47	줄었나 (18강)
표현형	—

두 번째가 계산의 검증이다

VIPER 가 예측한 레귤론 표적들 이 실제로 변하면 레귤론이 맞았다 는 증거다.

이것이 중요한 이유

레귤론은 추론된 것 이라 정답표가 없었다.

섭동 실험이 그 정답표를 조금 만들어 준다.

추론된 것을 실험으로 확인하면 그 추론 방법 자체가 검증된다

🤔 Check yourself

계산 결과만으로는 인과를 말할 수 없는 이유는?

🤔 Check yourself

논문이 shRNA 녹다운과 CRISPR 녹아웃을 모두 한 이유는?

🤔 Check yourself

퓨로마이신을 뿌리는 목적은?