Lesson 19 of 20

Phase IV — 동종이식 생쥐 4군과 항-PD1 투여

프로토콜 Phase IV · 접종 · 무작위 배정 · 투약 일정

배양 접시에서 유전자를 껐더니 표면단백이 줄었습니다. 그런데 우리가 정말 알고 싶은 것은 면역세포가 실제로 종양 안으로 들어오는가 입니다. 접시 안에는 면역세포가 없으니 이건 몸 안에서만 볼 수 있습니다.

동종이식(syngeneic) 모델이란

사람 암세포를 생쥐에 넣으면 면역계가 남의 것으로 알아보고 거부합니다. 그래서 면역결핍 생쥐를 쓰는데, 그러면 면역치료를 연구할 수 없습니다 — 면역계가 없으니까요.

해법은 유전적으로 같은 계통의 생쥐와 암세포를 쓰는 것입니다.

세포주	유래 계통	넣을 생쥐
LLC1 (Lewis 폐암)	C57BL/6	C57BL/6
KLN205 (편평세포 폐암)	DBA/2	DBA/2

이러면 면역계는 멀쩡한데 암은 거부당하지 않는 상황이 만들어집니다. 면역항암제를 연구할 수 있는 유일한 조건이죠.

High school동종이식 생쥐 4군

세포 실험 다음은 동물 실험 이다.

군	처리
1	대조 + 대조
2	녹다운 + 대조
3	대조 + 항-PD1
4	녹다운 + 항-PD1

2×2 설계다

두 요인의 단독 효과 와 상호작용 을 볼 수 있다.

4군이 있어야 시너지를 말할 수 있다 — 2군으로는 못 한다

프로토콜 Phase IV-1 · 접종

암세포를 PBS 에 띄워 생쥐 등쪽 피부 아래에 주사합니다. 프로토콜은 1 × 10⁶ 세포를 지정하고 있습니다.

프로토콜과 논문 부록의 숫자가 다릅니다

프로토콜 문서는 1 × 10⁶ 세포, 논문 SI Appendix 는 LLC1 1 × 10⁵ / KLN205 5 × 10⁵ 세포(PBS 100 µL)로 적고 있습니다.
접종 세포 수는 종양이 자라는 속도를 크게 좌우하므로, 실제로 실험할 때는 어느 쪽을 따르는지 반드시 명시해야 합니다. 이 강의는 프로토콜 문서를 기준으로 하되 원 논문 값을 함께 적어 둡니다.

프로토콜 Phase IV-2 · 무작위 배정

종양이 만져질 만큼(약 50–100 mm³) 자라면 생쥐를 네 무리로 나눕니다.

군	종양	투여	이 군이 답하는 질문
A	대조 (WT)	아이소타입 대조 항체	기준선 — 아무것도 안 했을 때
B	대조 (WT)	항-PD1	항-PD1 단독의 효과는?
C	DDX54 결손	아이소타입 대조 항체	DDX54 억제 단독의 효과는?
D	DDX54 결손	항-PD1	둘을 함께 쓰면?

왜 네 무리여야 할까요? 시너지를 증명하려면 그렇습니다. A·B·C 를 모르면, D 가 좋아진 것이 항-PD1 때문인지 DDX54 때문인지 아니면 둘의 조합 때문인지 구별할 수 없습니다. D − A 가 (B − A) + (C − A) 보다 크면 그것이 시너지입니다.

프로토콜 Phase IV-3 · 투약

💉

경로

복강 내 주사 (i.p.)

⚖️

용량

항-PD1 100–200 µg / 마리

📅

일정

3일마다, 총 3–4회

논문 SI Appendix 의 실제 일정은 세포 주입 다음 날부터 2일 간격, 항-PD1 200 µg, 아이소타입 대조 100 µg (BioXCell) 입니다. IACUC 승인번호 KA2019-24.

아이소타입 대조 항체가 왜 필요한가

항체를 주사하는 행위 자체가 면역계를 자극합니다. 그래서 대조군에는 같은 종·같은 항체 종류(IgG2a)인데 아무것도 겨누지 않는 항체를 같은 용량으로 주사합니다. 그래야 관측된 차이가 PD1 을 막았기 때문이라고 말할 수 있습니다.

High school왜 항-PD1 을 함께 주나

가설은 이렇다 — 녹다운이 T세포를 불러오면 항-PD1 이 비로소 듣는다.

상태	항-PD1 효과
T세포 없음	없음 — 풀어 줄 것이 없음
T세포 있음	있음

그러니 시너지가 예상된다

녹다운 단독 — 약간의 효과
항-PD1 단독 — 거의 없음
둘 다 — 큰 효과

각각은 부족하고 함께여야 듣는 조합 — 그것이 이 가설의 예측이다

네 군이 다 있어야 이 뺄셈을 할 수 있습니다. 하나라도 빠지면 시너지를 말할 수 없습니다.

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# 2x2 설계에서 '시너지'가 어떻게 정의되는지 숫자로 확인합니다.
# 값은 논문 Fig 4B-D 의 서술을 옮긴 예시입니다 (실제 측정치가 아닙니다).

기준 = 100          # A군 종양 크기를 100 으로 둡니다

A = 100             # WT + 아이소타입
B = 92              # WT + 항-PD1        → 단독으로는 거의 효과 없음
C = 78              # KD + 아이소타입     → 단독으로는 약간 효과
D = 18              # KD + 항-PD1        → 극적인 감소

효과_PD1 = A - B
효과_KD  = A - C
효과_병용 = A - D
합산기대 = 효과_PD1 + 효과_KD

print("각 군의 종양 크기 (A군 = 100 기준)")
for 이름, v in [("A  WT+아이소타입", A), ("B  WT+항PD1", B),
                ("C  KD+아이소타입", C), ("D  KD+항PD1", D)]:
    print(f"  {이름:<20} {v:>5}   " + "█" * int(v/4))
print()
print(f"항-PD1 단독 효과      : {효과_PD1:>5}")
print(f"DDX54 억제 단독 효과  : {효과_KD:>5}")
print(f"둘을 더한 기대 효과   : {합산기대:>5}   ← 시너지가 없다면 이만큼")
print(f"실제 병용 효과        : {효과_병용:>5}")
print()
print(f"시너지 = {효과_병용} - {합산기대} = {효과_병용 - 합산기대:+}")
print("실제가 기대를 크게 넘어섭니다 — 이것이 '상승효과' 의 정의입니다.")

High school동종이식이라는 것

	동종이식	이종이식
세포	같은 종 생쥐	사람 세포
숙주	면역 정상	면역결핍
면역 연구	가능	불가

면역 연구에는 동종이식이 필수다

이종이식은 면역이 없는 생쥐를 쓴다. 면역치료 효과를 볼 수 없다.

그런데 대가가 있다

생쥐 세포를 써야 하니 사람 유전자를 직접 못 본다.

사람 DDX54 대신 생쥐 Ddx54 를 조작한다.

면역을 보려면 면역이 있는 계가 필요하고, 그러면 종이 달라진다

🎮 4군 설계기

각 군의 효과를 조절해 보면서 어떤 조합에서 시너지라고 부를 수 있는지 확인하세요. 군을 하나 빼 보면 왜 4군이 필요한지도 알 수 있습니다.

High school무작위 배정과 맹검

절차	막는 편향
무작위 배정	군 사이의 체계적 차이
맹검 측정	측정자의 기대
사전 정한 종점	결과를 보고 고르기

동물 실험에서 자주 빠진다

임상시험에서는 필수 인데 동물 실험에서는 안 하는 경우 가 많다.

그것이 동물 실험의 재현성 문제 의 큰 원인이다.

종양 크기 측정이 특히 그렇다

캘리퍼로 재는데 주관이 들어간다. 어느 군인지 알면 무의식적으로 편향된다.

주관이 들어가는 측정일수록 맹검이 중요하다

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동종이식(syngeneic) 생쥐 모델을 쓰는 이유는?

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시너지를 증명하려면 네 무리가 모두 필요한 이유는?

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아이소타입 대조 항체를 주사하는 목적은?