Lesson 3 of 20

표본 고르기 — 11,070명에서 시작한다

프로토콜 Phase I 준비 · 항원제시 경로가 멀쩡한 환자만

"면역 사막을 만드는 범인"을 찾으려면 먼저 진짜 면역 사막인 환자만 골라야 합니다. 여기서 실수하면 뒤의 계산이 전부 헛됩니다.

논문 저자들이 만든 깔때기는 이렇습니다.

단계	남는 표본	왜
WES · RNA-seq · H&E 가 모두 있는 TCGA 표본	11,070	세 가지가 다 있어야 TMB · 발현 · 침윤을 한 표본에서 잰다
원발암만 (정상 · 전이 제외)	9,707	정상 조직과 전이는 면역 환경이 전혀 다르다
항원제시 경로에 변이 없음	7,570	여기가 핵심 — 아래 설명
H&E 딥러닝으로 침윤 판정	3,055 (brisk)	Saltz 등의 TIL 지도

왜 항원제시 경로 변이를 빼야 하나

면역세포가 암세포를 알아보는 과정은 이렇습니다 — 암세포가 자기 안의 단백질을 잘게 잘라 MHC 라는 접시 위에 올려 창밖에 내놓으면, 지나가던 T세포가 그 접시를 들여다보고 "이건 이상한 조각이다" 하고 판단합니다.

그런데 그 접시를 만들고 나르는 부품(HLA, B2M, TAP1/2, TAPBP …)에 변이가 생기면, 암세포는 돌연변이가 아무리 많아도 아무것도 내보이지 못합니다. 이런 종양에 림프구가 없는 것은 하나도 이상하지 않아요 — 이미 설명이 끝난 사건입니다.

우리가 찾는 것은 접시는 멀쩡한데도 면역세포가 못 들어오는 경우입니다. 그래서 이미 설명이 되는 표본은 미리 빼 둡니다. 이것이 "교란 요인을 설계 단계에서 제거한다" 는 뜻입니다.

High school11,070명에서 시작한다

TCGA 범암 자료에서 11,070명 으로 시작한다.

왜 이렇게 많이	내용
ARACNE 가 요구	수백 샘플 이상
DIGGIT 이 요구	변이 + 발현이 함께
희귀 변이를 보려면	검정력

방법이 큰 표본을 요구하니 여러 암종을 합쳐야 한다

이 강의의 표본 선택 — 논문과 어디가 같고 어디가 다른가

같은 것 — TCGA 자료, 원발암만, 항원제시 경로 40개 유전자에 변이 없는 표본만, TMB ≥ 10 mut/Mb 기준.

다른 것 — 논문은 H&E 병리 이미지에 딥러닝을 돌린 Saltz 등의 TIL 지도로 brisk / non-brisk 를 갈랐습니다. 우리는 무리를 가르는 자로 Thorsson 등이 발표한 림프구 침윤 발현 점수(LIexpression_score) 를 씁니다. 둘 다 널리 쓰이는 지표지만 같은 것은 아닙니다 — 이 차이가 16강에서 결과 차이의 원인 중 하나로 다시 나옵니다.

다만 지도 자체는 가져왔습니다. Saltz 등의 TIL 지도는 TCIA 가 CC BY 3.0 으로 공개하고 있어서, 폐선암 슬라이드 542장분을 이 강의에 실었습니다. 바로 아래에서 그 지도를 열어, 논문이 쓴 침윤 숫자를 우리 손으로 다시 셉니다. 싣지 못한 것은 brisk / non-brisk 라는 범주 라벨 하나뿐입니다 — 그것은 지도가 아니라 병리의사가 눈으로 붙인 판정이고, 논문 보충표에만 있습니다.

논문이 본 그 지도를 직접 연다

Saltz 등이 만든 것은 표가 아니라 그림입니다. H&E 슬라이드 한 장(가로가 10만 픽셀을 넘습니다)을 50 × 50 ㎛ 짜리 조각으로 잘게 나눈 다음, 조각마다 합성곱 신경망이 "여기 림프구가 두 개 이상 있는가" 를 판정합니다. 그 판정을 조각의 자리에 그대로 찍으면, 슬라이드 한 장이 작은 그림 한 장이 됩니다.

🟥

빨강

림프구가 있는 조각

🟦

파랑

조직인데 림프구가 없는 조각

⬛

검정

조직이 아닌 빈 유리

그래서 침윤 정도를 재는 일이 픽셀을 세는 일이 됩니다.

TIL 비율 (%) = 빨강 조각 ÷ (빨강 + 파랑) × 100

폐선암 지도 한 장은 2 KB 에서 50 KB 밖에 안 됩니다. 542장을 다 합쳐도 7 MB 예요. 원본 H&E 슬라이드가 한 장에 수백 MB 인 것과 견주면, 딥러닝이 이미 요약을 끝내 놓은 결과물이라는 뜻입니다.

왼쪽은 붉은 점이 거의 없고, 오른쪽은 조직의 절반이 붉습니다. 논문이 brisk / non-brisk 라고 부른 것이, 눈으로 보면 이 차이입니다.

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import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt

def til_map(pid):
    """TCIA 가 공개한 TIL 지도 한 장. 픽셀 하나 = H&E 슬라이드의 50x50um 조각."""
    a = (plt.imread(f"TILmap_{pid}.png")[:, :, :3] * 255).round().astype(int)
    r, g, b = a[:, :, 0], a[:, :, 1], a[:, :, 2]
    til    = (r == 255) & (g == 0) & (b == 0)      # 빨강 - 림프구가 있는 조각
    tissue = (r == 0)   & (g == 0) & (b == 255)    # 파랑 - 조직인데 림프구가 없다
    return a, til, tissue

fig, axes = plt.subplots(1, 2, figsize=(9.5, 4.2))
for ax, (pid, tag) in zip(axes, [("TCGA-05-4397", "low infiltration"),
                                 ("TCGA-44-2668", "high infiltration")]):
    a, til, tissue = til_map(pid)
    n_til = int(til.sum())
    n_tis = int(til.sum() + tissue.sum())
    pct   = 100 * n_til / n_tis
    print(pid)
    print(f"   지도 크기        : {a.shape[1]} x {a.shape[0]} 조각")
    print(f"   조직 조각        : {n_tis:,} 개")
    print(f"   림프구 있는 조각 : {n_til:,} 개")
    print(f"   TIL 비율         : {pct:.2f} %")
    print()
    ax.imshow(a)
    ax.axis("off")
    ax.set_title(f"{pid}\n{tag} - TIL {pct:.1f}%", fontsize=10)
fig.tight_layout()

우리가 그은 선은 방향은 맞습니다 — 사막 쪽 중앙값 4%, 염증 쪽 13%. 그런데 두 지표의 상관은 rho = 0.4 밖에 되지 않습니다. 같은 것을 재고 있지 않다는 뜻이고, 이 숫자가 16강에서 다시 나옵니다.

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import pandas as pd, gene
from scipy import stats

til = pd.read_csv("TCGA_LUAD_TILmap.tsv", sep="\t")
print("TCIA TIL 지도 :", len(til), "장 (환자 한 명에게 슬라이드가 여러 장인 경우가 있다)")

# 환자당 한 장만 남긴다 - 조직 조각이 가장 많은, 곧 가장 크게 잘린 슬라이드
til = til.sort_values("tissue_patches").drop_duplicates("participant", keep="last")

m = gene.meta().copy()
m["participant"] = [s[:12] for s in m.index]     # TCGA-05-4397-01 -> TCGA-05-4397
j = m.merge(til, on="participant")
print("우리 512 표본 중 지도가 있는 표본 :", len(j), "명")
print()

sub = j[j.group.isin(["desert", "inflamed"])]
print("두 무리의 중앙값")
print(sub.groupby("group")[["LI", "til_pct"]].median().round(2).to_string())
u = stats.mannwhitneyu(sub[sub.group == "desert"].til_pct,
                       sub[sub.group == "inflamed"].til_pct)
print()
print(f"H&E 로 잰 TIL 비율의 두 무리 차이 : Mann-Whitney p = {u.pvalue:.4f}")

k = j.dropna(subset=["LI"])
rho, p = stats.spearmanr(k.LI, k.til_pct)
print(f"발현 기반 LI 와 H&E TIL 비율의 상관 : rho = {rho:.2f} (p = {p:.1e}, n = {len(k)})")

High school항원제시 경로가 멀쩡한 환자만

중요한 선별 기준 이다.

제외	이유
B2M 소실	MHC 를 못 내걺
HLA LOH	일부 항원을 못 보임
항원제시 기계 결함	—

왜 빼나

이런 환자는 T세포가 볼 수가 없어서 안 온다. 이유가 이미 설명된다.

우리가 찾는 것은 볼 수 있는데도 안 오는 경우다.

설명되는 경우를 빼면 설명되지 않는 경우에 집중할 수 있다

논문의 11,070 → 3,055 과 규모는 다르지만, 거르는 논리는 똑같습니다.

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# 우리 깔때기를 숫자로 확인합니다.
import gene

m = gene.meta()
print("발현 자료가 있는 TCGA-LUAD 원발암 :", len(m), "표본")

# meta 표에는 항원제시 필터를 통과하고 침윤 점수까지 있는 표본만 TMB 가 채워져 있습니다.
kept = m[m.TMB.notna()]
print("항원제시 경로 정상 + 침윤 점수 있음 :", len(kept))

tmbh = kept[kept.TMB >= 10]
tmbl = kept[kept.TMB <  10]
print("  TMB-H (>=10 mut/Mb) :", len(tmbh))
print("  TMB-L (<10 mut/Mb)  :", len(tmbl))
print()

# TMB-H 안에서 침윤 점수 하위 1/3 = 면역 사막, 상위 1/3 = 면역 염증
print(m.group.value_counts().to_string())

TMB 는 어떻게 세나

TMB 의 정의는 아주 단순합니다.

TMB (개/Mb) = 종양에서 찾은 돌연변이 총 개수 ÷ 38

38 은 사람 엑솜(단백질을 만드는 부분만 모은 것)의 대략적인 길이가 38 메가베이스이기 때문입니다. 300개 변이가 나왔다면 300 ÷ 38 ≈ 7.9 개/Mb 이고, FDA 기준 10 에 못 미치니 TMB-L 입니다.

왜 나누어야 할까요? 검사 패널마다 읽는 길이가 다르기 때문입니다. 길이로 나누어야 서로 다른 검사끼리 비교할 수 있습니다 — "몇 개"가 아니라 "밀도"로 재는 것이죠.

분포가 오른쪽으로 길게 늘어져 있습니다 — 그래서 평균이 아니라 중앙값을 봅니다.

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import gene
m = gene.meta()
kept = m[m.TMB.notna()].copy()

# TMB 는 변이 총 개수를 38 Mb 로 나눈 값입니다. 역산해서 확인해 봅니다.
kept["recomputed"] = kept.n_mut / 38.0
print("직접 계산한 값과 표에 있는 값이 같은가:",
      bool((kept.recomputed - kept.TMB).abs().max() < 1e-9))
print()

# 분포를 봅니다 — 소수의 환자가 아주 큰 값을 가집니다
q = kept.TMB.quantile([0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 0.9, 0.99])
for k, v in q.items():
    print(f"  {int(k*100):>3}% 분위 : {v:8.2f} 개/Mb")
print()
print("최대값:", round(kept.TMB.max(), 1), "개/Mb")
print("FDA 기준 10 이상:", int((kept.TMB >= 10).sum()), "명",
      f"({(kept.TMB >= 10).mean()*100:.0f}%)")

그런데 왜 하필 폐선암이었을까요

여기까지 우리는 폐선암(LUAD)을 이미 정해진 것처럼 다뤘습니다. 하지만 논문은 그렇게 시작하지 않았어요. TCGA 전체를 놓고 장기별로 견주어 폐선암을 골랐습니다 — 논문 Fig. 1B·1C 입니다.

물음은 두 개였습니다.

Fig. 1B — 역설이 진짜인가

TMB 가 높은데도 면역 사막인 종양이 실제로 많은가? 그리고 그 사막과 염증 사이에 TMB 차이가 없는가?

Fig. 1C — 어느 장기가 가장 심한가

TMB-H ∩ 면역사막 표본이 어느 암종에 가장 많은가? 우연히 기대되는 수보다 많은가(초기하검정)?

이 물음을 우리 손으로 다시 물어볼 수 있습니다. 재료 세 가지를 붙이면 됩니다 — /til 강의의 H&E TIL 지도 5,202장(암종 13가지), cBioPortal 의 돌연변이 개수(표본 10,443), 그리고 항원제시경로 49개 유전자의 변이 목록. 미리 붙여 두었습니다.

TMB-H 안에서 면역 사막의 비율 — 논문의 '약 30%' 와 견주어 보세요.

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# 논문 Fig. 1B - 역설이 진짜인가
# 자료: H&E TIL 지도 + cBioPortal 변이개수(TMB = 개수 / 38 Mb) + 항원제시 변이
import gene

F = gene.facts()["pancancer"]
f = F["funnel"]
print("범암 깔때기")
print(f"  슬라이드 {f['slides']}장 -> 환자 {f['patients']}명")
print(f"  변이 개수를 아는 환자      : {f['with_tmb']}")
print(f"  항원제시 경로가 멀쩡한 환자 : {f['ap_intact']}")
print(f"  그중 TMB-H (>= 10/Mb)     : {f['tmbh']}")
print()
print("면역 사막 비율 (H&E TIL < 5%)")
for b in F["bars"]:
    print(f"  {b['label']:<6} n={b['n']:>5}   사막 {b['desert']:>5.1f}%")
print()
print("논문: TMB-H 표본의 약 30%가 면역사막이다.")

High school암종을 섞는 것의 문제

문제	내용
암종마다 기준선이 다름	침윤률 · 변이 부담
조절망이 다름	조직 특이적
심슨의 역설	합치면 부호가 뒤집힐 수 있음

그런데 합쳐야 표본이 된다

한 암종만으로는 수백 명 이다. DIGGIT 을 돌리기에 부족하다.

그래서 절충한다

대응	내용
암종을 공변량으로	회귀에 넣음
암종 안에서 표준화	기준선을 맞춤
암종별로 나눠 확인	일관되나

표본을 늘리려 합치면 이질성이 들어온다 — 그 둘을 저울질해야 한다

논문은 LUAD 가 가장 많고 유의하다고 했습니다. 우리 계산은 어떤가요?

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# 논문 Fig. 1C - 어느 암종에 TMB-H 면역사막이 가장 많은가
import gene

F = gene.facts()["pancancer"]
print(f"{'암종':<7}{'TMB-H':>7}{'사막':>6}{'비율':>8}{'기대':>7}{'초기하 p':>11}")
for r in F["rows"]:
    star = " *" if r["p"] < 0.05 else ""
    print(f"{r['tumor']:<7}{r['n_tmbh']:>7}{r['n_desert']:>6}"
          f"{r['pct']:>7.1f}%{r['exp']:>7.1f}{r['p']:>11.4f}{star}")
print()
print("* = 우연히 기대되는 수보다 유의하게 많다")

여기서 논문과 갈립니다 — 그리고 그 이유가 16강의 예고편입니다

논문 Fig. 1C 는 LUAD 가 가장 많고 유의하다고 적었습니다. 우리 계산에서는 —

✔ 맞은 것 — LUAD 는 TMB-H 표본 수가 71명으로 가장 많습니다.
✘ 어긋난 것 — 사막 표본 수는 SKCM(피부흑색종) 30명이 LUAD 22명보다 많고, 초기하검정에서 유의한 것도 SKCM 하나뿐입니다 (p = 0.026). LUAD 는 p = 0.94 예요.

왜 갈렸을까요? 우리는 사막/염증을 H&E 지도에서 직접 센 TIL 5% 로 갈랐고, 논문은 Saltz 팀의 brisk / non-brisk 병리 판정을 썼습니다. 같은 슬라이드를 보고도 세는 자가 다르면 순위가 바뀝니다.

이것이 16강에서 다룰 재현 격차의 첫 번째 이유이고, 여기서 이미 그 위력을 봅니다 — 표본을 가르는 자가 결론을 가릅니다.

High school선별이 결과를 정한다

어떤 환자를 넣고 뺐느냐가 어떤 답이 나올지 를 정한다.

선별	찾게 되는 것
항원제시 정상만	제시 외의 기전
전부 포함	제시 결함이 상위에 나옴

그러니 선별 기준을 명시해야 한다

"이 결과는 항원제시가 정상인 환자 에서 얻은 것" 이라고 적어야 한다.

그리고 일반화의 범위가 정해진다

항원제시가 망가진 환자에게는 이 결론이 적용되지 않는다.

선별 기준이 결론이 적용되는 범위를 정한다

🎮 깔때기 실험실

필터를 하나씩 켜고 끄면서 표본이 얼마나 줄어드는지, 그리고 어떤 필터를 빼면 결론이 오염되는지 확인해 보세요.

🤔 Check yourself

항원제시 경로(HLA · B2M · TAP)에 변이가 있는 표본을 미리 빼는 이유는?

🤔 Check yourself

TMB 를 셀 때 돌연변이 개수를 38 로 나누는 까닭은?

🤔 Check yourself

우리가 논문과 달리 발현 기반 림프구 침윤 점수를 쓴 결과로 예상되는 것은?