7강 / 22강

음성 대조군 — 거짓양성률을 내가 직접 잰다

있을 리 없는 탐침 649종 · 세포당 거짓 분자 0.31개

모든 측정에는 거짓양성이 있습니다. 문제는 보통은 얼마나 되는지 알 수 없다는 것이죠. Xenium 은 이 문제를 아주 우아하게 풉니다.

있을 리 없는 것을 일부러 함께 찾게 한다.
그게 잡히는 만큼이 곧 거짓양성률이다.

이 패널에는 유전자 5,006개 말고도 대조군이 잔뜩 들어 있습니다. 5강에서 본 features 표를 종류별로 세어 보면 이렇습니다.

종류	개수	무엇인가
Gene Expression	5,006	진짜로 보고 싶은 유전자
Negative Control Probe	40	생쥐 전사체에 없는 서열을 겨냥한 탐침 — 탐침이 엉뚱하게 붙는 정도를 잰다
Negative Control Codeword	609	어떤 탐침에도 배정되지 않은 색 조합 — 해독 과정이 만들어 내는 잡음을 잰다
Genomic Control	21	DNA 를 겨냥 — RNA 가 아닌 것이 잡히는 정도
Unassigned / Deprecated	8,104	쓰이지 않는 codeword 자리

대조군 두 종류가 서로 다른 오차를 잰다는 점이 핵심입니다. 탐침이 잘못 붙는 것과, 색을 잘못 읽는 것은 별개의 문제니까요.

고등학생거짓양성률을 직접 잰다

대부분의 자료에서 "이 값이 진짜인가" 를 재기 어렵다. 그런데 Xenium 은 음성 대조군 을 넣어 준다.

대조군 종류	내용
negative control probe	실제 서열에 안 붙는 탐침
negative control codeword	어느 유전자에도 할당 안 한 코드
unassigned codeword	해독은 됐는데 매칭 안 됨

모두 합쳐 649종 이다. 이것들이 잡히면 전부 거짓양성 이다.

있을 리 없는 것을 함께 재면 거짓양성률을 직접 알 수 있다

이름만 봐도 진짜 유전자가 아니라는 것이 드러나게 지어 두었습니다.

Python 브라우저에서 실행

# 패널이 무엇으로 이루어져 있는지 직접 세어 봅니다.
import sp, numpy as np, pandas as pd

이름 = sp.feature_names()
종류 = sp.feature_types()
print(pd.Series(종류).value_counts().to_string())
print(f"\n합계 {len(종류):,}개 특징")

print("\n음성 대조 탐침 이름 예시:")
print("  ", list(이름[종류 == "Negative Control Probe"])[:5])
print("음성 대조 codeword 이름 예시:")
print("  ", list(이름[종류 == "Negative Control Codeword"])[:5])

고등학생세포당 거짓 분자 0.31개

계산하면 세포당 0.31개 의 거짓 분자가 나온다.

이것을 어떻게 쓰나

유전자의 세포당 검출	판단
0.3개	배경과 구별 안 됨
2개	배경의 6배 — 애매
20개	확실히 신호

검출 한계를 정하는 근거가 된다

"세포당 몇 개 이상이면 발현으로 볼 것인가" 를 추측이 아니라 측정 으로 정할 수 있다.

21강에서 이 함정을 다시 만난다 — 세포당 2개 잡히는 유전자로 결론을 내리는 실수.

검출 한계를 모르면 잡음을 신호로 읽는다

개수로 나누어 비교하는 것이 핵심입니다. 대조군은 40개, 유전자는 5,006개니까요.

Python 브라우저에서 실행

# 이 시야에서 대조군이 실제로 얼마나 잡혔나 — 거짓양성률을 직접 계산합니다.
import sp, numpy as np

tx = sp.transcripts()
종류 = sp.feature_types()
g = tx.gene.values

유전자 = np.isin(g, np.where(종류 == "Gene Expression")[0])
음성탐침 = np.isin(g, np.where(종류 == "Negative Control Probe")[0])
음성코드 = np.isin(g, np.where(종류 == "Negative Control Codeword")[0])

n_probe = (종류 == "Negative Control Probe").sum()
n_code  = (종류 == "Negative Control Codeword").sum()
n_gene  = (종류 == "Gene Expression").sum()

print(f"분자 {len(g):,}개 중")
print(f"  진짜 유전자      {유전자.sum():>9,} ({유전자.mean()*100:5.2f}%)")
print(f"  음성 대조 탐침   {음성탐침.sum():>9,} ({음성탐침.mean()*100:5.3f}%)")
print(f"  음성 대조 codeword {음성코드.sum():>7,} ({음성코드.mean()*100:5.3f}%)")

# 개수가 다르므로 '탐침 하나당' 으로 맞춰 비교해야 공정합니다
print(f"\n탐침 하나당 잡힌 분자 수")
print(f"  진짜 유전자    {유전자.sum()/n_gene:8.1f}개")
print(f"  음성 대조 탐침 {음성탐침.sum()/n_probe:8.1f}개  ← 이만큼이 잡음")
print(f"  음성 codeword  {음성코드.sum()/n_code:8.1f}개")
print(f"\n→ 잡음 대비 신호비 약 {유전자.sum()/n_gene / max(음성탐침.sum()/n_probe, 1e-9):.0f}배")

고등학생이런 대조군이 왜 귀한가

보통의 자료	Xenium
거짓양성률을 추정해야 함	직접 측정
모형과 가정이 필요	가정이 거의 없음

실험 설계에 대조군을 넣는다는 것

이것은 자료를 만들 때 결정된 것이다. 분석 단계에서는 만들 수 없다.

좋은 실험 설계가 나중의 분석을 가능하게 한다는 좋은 예다.

분석으로 못 푸는 문제를 실험 설계가 미리 풀어 준다

'세포당 거짓 분자 0.31개' 를 읽는 법

Xenium 이 metrics_summary.csv 에 넣어 주는 estimated_number_of_false_positive_transcripts_per_cell 이 바로 이 계산의 결과입니다. WT_ISO 에서 0.31개 였어요.

세포당 진짜 분자가 294개인데 거짓이 0.31개면 0.1% 수준입니다. 아주 좋은 값이죠.

그런데 여기에 함정이 있습니다. 거짓 분자는 5,006개 유전자에 고루 흩어집니다. 그러면 원래 거의 안 켜지는 유전자에게는 이 잡음이 치명적이에요. 한 세포에서 3개만 잡히는 유전자라면, 그중 하나가 가짜일 수도 있는 겁니다.

발현이 낮은 유전자일수록 잡음의 비중이 커진다 — 공간 자료를 읽을 때 늘 기억해야 할 규칙입니다.

발현이 낮은 유전자에서는 잡음 비중이 수십 % 까지 올라갑니다. 그런 유전자로 결론을 내면 안 됩니다.

Python 브라우저에서 실행

# 발현이 낮은 유전자일수록 잡음 비중이 크다 — 직접 확인합니다.
import sp, numpy as np

tx = sp.transcripts()
이름 = sp.feature_names(); 종류 = sp.feature_types()
cnt = np.bincount(tx.gene.values, minlength=len(이름))

n_probe = (종류 == "Negative Control Probe").sum()
잡음수준 = cnt[종류 == "Negative Control Probe"].mean()      # 탐침 하나가 만들어 내는 가짜 분자 수
print(f"음성 대조 탐침 하나당 평균 {잡음수준:.1f}개가 '잡힙니다' — 이것이 잡음의 크기입니다.\n")

유전자idx = np.where(종류 == "Gene Expression")[0]
c = cnt[유전자idx]
for lo, hi, 라벨 in [(0, 10, "아주 낮음 (<10)"), (10, 50, "낮음 (10~50)"),
                    (50, 500, "보통 (50~500)"), (500, 10**9, "높음 (>500)")]:
    m = (c >= lo) & (c < hi)
    if not m.sum(): continue
    비율 = 잡음수준 / np.maximum(c[m].mean(), 1e-9) * 100
    print(f"  {라벨:16} 유전자 {m.sum():>4,}개 · 평균 {c[m].mean():8.1f}개 · "
          f"그중 잡음이 차지할 비중 ≈ {비율:5.2f}%")

고등학생거짓양성이 어디서 오나

원인	내용
광학 잡음	형광 자가발광 · 먼지
탐침 비특이 결합	엉뚱한 곳에 붙음
해독 오류	5강의 코드워드 오독
조직 자가형광	특히 적혈구 · 색소

공간적으로 균일하지 않다

자가형광이 강한 부위에서 거짓양성이 몰린다. 그러면 그 부위에서 없는 유전자가 있는 것처럼 보인다.

그래서 음성 대조도 공간적으로 봐야 한다

음성 대조 분자를 지도에 찍어 특정 부위에 몰려 있는지 확인한다.

몰려 있으면 그 부위의 결과는 덜 믿어야 한다.

잡음이 균일하지 않으면 잡음의 지도도 함께 그려야 한다

🤔 확인 문제

음성 대조 탐침(Negative Control Probe)이란?

🤔 확인 문제

음성 대조 탐침과 음성 대조 codeword 를 둘 다 넣는 이유는?

🤔 확인 문제

세포당 거짓 분자가 0.31개일 때, 어떤 유전자에서 가장 위험할까요?