13강 / 22강

의사대량 — 세포를 표본으로 되돌린다

세포유형마다 표본별로 합치기 · 그리고 합쳐 놓고도 할 수 없는 것

8강에서 본 유사복제를 피하는 표준적인 방법이 의사대량(pseudobulk) 입니다.

세포유형마다, 표본마다 카운트를 통째로 더한다.
그러면 세포 37,585개가 표본 4개 × 세포유형 n개 의 표가 된다.

더하고 나면 그것은 그 세포유형만 골라 한 대량 RNA-seq 과 같습니다. 그리고 대량 RNA-seq 의 통계 도구(DESeq2·edgeR)를 그대로 쓸 수 있죠 — 표본이 충분하다면요.

고등학생세포를 표본으로 되돌린다

8강에서 본 유사복제를 피하는 표준적인 방법이 의사대량(pseudobulk) 이다.

방법

단계	하는 일
1	세포유형과 표본으로 세포를 나눈다
2	각 (유형 × 표본) 안의 세포 발현을 합친다
3	그러면 표본당 하나의 값이 나온다
4	그것을 덩어리 RNA-seq 처럼 분석한다

세포 3만 7천 개가 표본 넷 으로 되돌아간다.

단일세포로 얻은 자료를 통계적으로 정직한 단위로 되돌리는 것

세포를 더하면 UMI 수만 개짜리 대량 자료가 됩니다 — 잡음이 확 줄죠.

Python 브라우저에서 실행

import im

# 대식세포만 골라 표본마다 합쳐 본다
pb = im.pseudobulk("대식세포 (C1q+)")
print(f"모양 : {pb.shape[0]} 표본 × {pb.shape[1]} 유전자")
print()
print("표본별 총 카운트")
for s in im.SAMPLES:
    n = ((im.cells()["세포유형"] == "대식세포 (C1q+)") & (im.cells()["표본"] == s)).sum()
    print(f"  {s:<10}{pb.loc[s].sum():>10,.0f}  (세포 {n:>4}개)")
print()
print(pb.iloc[:, :6].to_string())

의사대량의 첫 관문 — 모든 조건에 세포가 충분히 있어야 합니다.

Python 브라우저에서 실행

import im
import numpy as np

# 세포유형마다 몇 개씩 있나 — 의사대량이 가능한지 먼저 본다
c = im.cells()
tab = im.comp()
print(f"{'세포유형':<18}" + "".join(f"{s:>10}" for s in im.SAMPLES) + f"{'가능?':>8}")
print("-" * 66)
for ct in tab.index:
    row = tab.loc[ct]
    ok = row.min() >= 20
    print(f"{ct:<18}" + "".join(f"{row[s]:>10,}" for s in im.SAMPLES) +
          f"{'가능' if ok else '부족':>8}")
print()
n_ok = (tab.min(axis=1) >= 20).sum()
print(f"네 표본 모두 20개 이상인 세포유형 : {n_ok} / {len(tab)}")
print("T세포 세부 유형은 대부분 부족합니다 — 정작 궁금한 세포인데요.")

고등학생왜 이것이 옳은 방법인가

문제	의사대량이 고치는 것
세포가 독립이 아님	표본 단위로 합쳐서 독립 단위를 만듦
p 값이 세포 수에 의존	표본 수가 n 이 됨
개체 간 변이를 무시	표본 간 변이를 직접 봄

시뮬레이션이 증명했다

여러 벤치마크 연구에서 세포 단위 검정은 위양성이 폭발 하고 의사대량은 잘 통제된다는 것이 확인되었다.

세포 단위로 검정하면 실제로는 차이가 없는 자료에서도 p < 0.05 가 절반 이상 나오기도 한다.

틀린 방법은 없는 차이를 만들어 낸다 — 그래서 더 위험하다

표는 만들어집니다. 검정만 못 할 뿐이죠.

Python 브라우저에서 실행

import im
import numpy as np

# 대식세포에서 KD_PD1 대 WT_CTRL 로 크게 변한 유전자
pb = im.pseudobulk("대식세포 (C1q+)")
cpm = im.cpm(pb)
lfc = np.log2(cpm.loc["KD_PD1"] + 1) - np.log2(cpm.loc["WT_CTRL"] + 1)
ok = cpm.min(axis=0) >= 20

top = lfc[ok].sort_values(ascending=False).head(8)
bot = lfc[ok].sort_values().head(8)
print(f"검정 대상 유전자 : {ok.sum()} (모든 표본에서 CPM ≥ 20)")
print()
print(f"{'유전자':<12}{'log2FC':>9}" + "".join(f"{s:>11}" for s in im.SAMPLES))
print("-" * 66)
for g in list(top.index) + list(bot.index):
    print(f"{g:<12}{lfc[g]:>+9.2f}" + "".join(f"{cpm.loc[s, g]:>11,.0f}" for s in im.SAMPLES))
print()
print("숫자는 나옵니다. 그런데 p 값이 없다는 것에 주목하세요.")

고등학생합쳐 놓고도 할 수 없는 것

의사대량으로 바꿔도 표본은 여전히 넷 이다. 그리고 조건당 하나다.

의사대량이 고치는 것	못 고치는 것
유사복제	표본 수 부족
가짜 유의성	진짜 유의성도 못 냄

8강의 결론이 여기서 다시 확인된다

정직한 방법으로 바꿨더니 아무것도 유의하지 않다. 이것은 방법이 나빠서가 아니라 설계가 그것을 허락하지 않아서 다.

세포 단위 검정에서 나오던 p < 0.001 은 방법이 만든 것 이었지 자료에 있던 것이 아니었다.

올바른 방법을 쓰면 없던 유의성이 사라진다 — 그것이 올바른 방법의 증거다

표본 안 비교는 표본이 하나여도 정당합니다 — 비교 단위가 세포유형이니까요.

Python 브라우저에서 실행

import im
import numpy as np

# 그래도 할 수 있는 것 — 세포유형 사이의 비교는 표본 안에서 가능하다
print("KD_PD1 한 표본 안에서, 세포유형마다 Cxcl9 발현")
print()
c = im.cells()
v = im.gene("Cxcl9")
sel_s = (c["표본"] == "KD_PD1").values
rows = []
for ct in im.comp().index:
    m = sel_s & (c["세포유형"] == ct).values
    if m.sum() >= 30:
        rows.append((ct, v[m].mean(), (v[m] > 0).mean() * 100, m.sum()))
rows.sort(key=lambda r: -r[1])
print(f"{'세포유형':<18}{'평균':>8}{'켜진 비율':>10}{'세포':>8}")
print("-" * 46)
for ct, mu, det, n in rows[:8]:
    print(f"{ct:<18}{mu:>8.3f}{det:>9.1f}%{n:>8,}")
print()
print("이 비교는 한 생쥐 안에서 이뤄지므로 유사복제 문제가 없습니다.")
print("'어느 세포가 이 유전자를 켜나' 는 이 자료가 잘 답하는 질문입니다.")

🎮 의사대량 실험실

세포유형을 골라 표본별 합계를 보고, 세포가 몇 개나 있어야 안정되는지 확인하세요.

고등학생그럼 의사대량을 왜 하나

얻는 것	내용
정직한 효과 크기	세포 수에 안 휘둘림
기존 도구 사용	DESeq2 · edgeR 을 그대로 씀
다른 자료와 비교 가능	덩어리 자료와 견줄 수 있음
다음 실험 설계의 근거	표본 간 변이 추정

그리고 습관을 만든다

표본이 충분할 때 제대로 된 분석이 어떤 모양인지 를 지금 연습해 두는 것이다.

다음에 조건당 다섯 마리짜리 자료를 받으면 바로 이 절차를 쓰면 된다. 그때 세포 단위 검정으로 돌아가지 않기 위해.

표본이 부족할 때도 옳은 절차를 연습해 두는 것이 낫다

🤔 확인 문제

의사대량(pseudobulk)이 하는 일은?

🤔 확인 문제

의사대량으로 합쳐 놓고도 이 자료에서 DESeq2 를 쓸 수 없는 이유는?

🤔 확인 문제

'어느 세포유형이 Cxcl9 를 켜나' 라는 질문이 이 자료로 답할 수 있는 이유는?