5강 / 20강

UMI — 같은 분자를 두 번 세지 않기

PCR 이 만든 사본을 어떻게 걸러 내는가

역전사로 만든 cDNA 는 양이 너무 적어서 그대로는 못 읽습니다. 그래서 PCR 로 11~13 사이클 불립니다. 2¹² 이면 약 4,000배예요.

여기서 문제가 생깁니다. 시퀀서가 어떤 유전자를 5,000번 읽었다고 할 때,

진짜였으면

원래 분자가 5,000개 있었다

그런데

원래 분자는 1개였고
PCR 이 5,000배 불렸을 수도 있다

PCR 효율은 유전자마다, 길이마다, GC 함량마다 다릅니다. 그러니 읽기 수를 그대로 발현량으로 쓰면 PCR 의 변덕을 발현량이라고 부르는 셈이에요.

고등학생같은 분자를 두 번 세지 않기

PCR은 DNA를 증폭합니다. 그런데 증폭 효율이 분자마다 달라요.

문제	내용
어떤 분자는 100배로	—
어떤 분자는 10배로	—
읽기 수를 세면	증폭 편향이 반영됨

읽기 수가 원래 분자 수를 반영하지 않습니다.

고등학생UMI가 푸는 방법

증폭 전에 각 분자에 고유한 이름표를 붙입니다.

단계	일어나는 일
역전사 시	분자마다 다른 UMI가 붙음
PCR	UMI까지 함께 복제됨
시퀀싱 후	같은 UMI = 같은 원래 분자
세기	읽기 수가 아니라 UMI 종류 수를 셈

100번 읽혔어도 UMI가 하나면 원래 분자는 하나입니다.

읽기 수와 UMI 수는 전혀 다른 숫자입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 읽기를 세는 것과 UMI 를 세는 것
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(7)

n_molecules = 6                       # 이 세포에 원래 있던 분자 수
umis = ["UMI-%02d" % i for i in range(n_molecules)]

# PCR 은 분자마다 서로 다른 배수로 불린다 (효율이 균일하지 않다)
copies = rng.integers(50, 900, size=n_molecules)

reads = []
for u, c in zip(umis, copies):
    reads += [u] * int(c)
rng.shuffle(reads)

print("원래 분자:      %d개" % n_molecules)
print("시퀀서가 읽은 것: %d개" % len(reads))
print("서로 다른 UMI:  %d가지" % len(set(reads)))
print()
print("분자별 사본 수:", list(copies))
print()
print("읽기를 세면 %d — PCR 의 변덕이 그대로 들어옵니다." % len(reads))
print("UMI 를 세면 %d — 원래 분자 수가 나옵니다." % len(set(reads)))

UMI 가 겹치면 어떻게 되나

12글자 UMI 로 만들 수 있는 조합은 4¹² = 16,777,216 가지입니다. 세포 하나가 담는 분자는 보통 수천 개니까, 겹칠 일은 드물어요. 그래도 아주 많이 발현되는 유전자에서는 우연히 겹칩니다.

겹치면 두 분자를 하나로 셉니다. 즉 UMI 세기는 아주 높은 발현량을 과소평가해요. v2 의 UMI 는 10글자(약 100만 가지)라 이 문제가 더 컸고, 그래서 v3 에서 12글자로 늘렸습니다.

고등학생UMI가 12 염기인 이유

UMI 길이	가능한 조합	충돌 위험
8	65,536	있음
12	약 1,670만	낮음

한 세포에서 한 유전자의 분자가 수백 개라면, 1,670만 중 수백 개를 뽑는 셈이에요. 겹칠 확률이 낮습니다.

다만 아주 많이 발현되는 유전자에서는 충돌이 생깁니다 — 그래서 포화 보정을 합니다.

왜 UMI 를 10글자에서 12글자로 늘렸는지.

Python 브라우저에서 실행

# UMI 가 겹칠 확률 — 생일 문제와 같은 셈
import math

def collision_prob(n_mol, umi_len):
    space = 4 ** umi_len
    # 하나도 안 겹칠 확률의 여집합 (근사)
    return 1 - math.exp(-n_mol * (n_mol - 1) / (2 * space))

for n in [100, 1000, 5000, 20000]:
    p10 = collision_prob(n, 10)
    p12 = collision_prob(n, 12)
    print("한 세포 안 분자 %6d개 ->  UMI 10글자 %5.1f%%   12글자 %5.1f%%"
          % (n, p10 * 100, p12 * 100))
print()
print("겹치면 두 분자를 하나로 셉니다 — 발현량을 낮게 봅니다.")
print("v2 는 10글자, v3 부터는 12글자를 씁니다.")

고등학생UMI 충돌과 보정

상황	결과
분자 수 ≪ UMI 종류	거의 안 겹침 — 정확
분자 수가 UMI 종류에 가까움	과소 계수

공을 상자에 던질 때, 상자가 적으면 같은 상자에 여러 개가 들어갑니다.

이 효과를 수학적으로 보정할 수 있어요. 다만 대부분의 유전자는 분자 수가 적어 문제가 안 됩니다.

🤔 확인 문제

UMI 를 붙이는 시점이 PCR 앞이어야 하는 이유는?

🤔 확인 문제

포화도가 95% 라는 것은 무슨 뜻인가?