Lesson 10 of 20

Cell Ranger — FASTQ 가 표가 되기까지

명령 한 줄과, 그 안에서 일어나는 여섯 단계

10x 가 만들어 배포하는 프로그램입니다. 쓰는 법은 놀랍도록 단순해요.

cellranger count \
  --id=pbmc_run1 \
  --transcriptome=/ref/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
  --fastqs=/data/fastq \
  --sample=pbmc \
  --create-bam=true
    

깃발	무엇
`--id`	결과 폴더 이름. 아무거나
`--transcriptome`	참조 유전체. 종이 틀리면 전부 틀린다
`--fastqs`	R1 · R2 파일이 든 폴더
`--sample`	파일 이름의 앞머리 (`pbmc`_S1_L001_R1_001.fastq.gz)
`--create-bam`	BAM 을 만들까. 안 만들면 수십 GB 를 아낀다

서버 한 대에서 서너 시간에서 하루쯤 걸립니다. 메모리는 64 GB 쯤 있어야 해요.

High schoolFASTQ가 표가 되기까지

Cell Ranger는 10x가 만든 처리 프로그램입니다. 명령 한 줄이면 표가 나와요.

단계	하는 일
1	바코드 읽고 오류 정정 (4강)
2	R2를 유전체에 정렬
3	유전자에 배정
4	UMI 중복 제거 (5강)
5	세포 판정 (14강)
6	표와 요약 리포트 생성

안에서 일어나는 여섯 단계

	단계	하는 일	여기서 버려지는 것
1	바코드 읽기	R1 앞 16글자를 화이트리스트에 맞춘다	못 고치는 바코드 (보통 2~3%)
2	정렬	R2 를 STAR 로 유전체에 붙인다	어디에도 안 붙는 읽기
3	유전자 배정	붙은 자리가 어느 유전자의 엑손인지 본다	여러 유전자에 걸친 읽기
4	UMI 세기	같은 (세포, 유전자, UMI) 는 하나로	PCR 사본 (대부분의 읽기!)
5	세포 판정	어느 바코드가 진짜 세포인가 (14강)	빈 방울 — 바코드의 99% 이상
6	미리 분석	PCA · 군집 · UMAP 을 돌려 둔다	—

High school명령 한 줄 뒤의 결정들

결정	영향
어느 참조 유전체	종 · 버전 · 주석
intron을 포함할까	포함하면 검출 유전자가 늘어남
예상 세포 수	14강의 세포 판정에 영향
Cell Ranger 버전	알고리즘이 바뀜

같은 FASTQ라도 이 설정에 따라 다른 표가 나옵니다 — 기록해야 합니다.

읽기 대부분은 UMI 세기에서 사라집니다 — 그것이 정상입니다.

Python Runs in your browser

# 읽기 100개가 어디로 사라지나 — 전형적인 비율
start = 100.0
steps = [
    ("바코드 못 고침",        2.5),
    ("유전체에 안 붙음",       8.0),
    ("유전자 밖(인트론/유전자간)", 12.0),
    ("여러 유전자에 걸침",      4.0),
]
left = start
print("읽기 100개로 시작합니다.")
for name, lost in steps:
    left -= lost
    print("  -%5.1f  %-24s ->  %5.1f 남음" % (lost, name, left))
print()
print("유전자에 확실히 붙은 읽기: %.1f%%" % left)
print()
sat = 0.88
print("그중 겹치지 않는 UMI: %.1f%%  (포화도 %.0f%%)" % (left * (1 - sat), sat * 100))
print("나머지는 전부 PCR 이 만든 사본입니다.")

High schoolintron 포함 여부

최근 버전은 인트론 read도 세는 것이 기본입니다. 왜일까요?

이유	내용
미성숙 RNA도 세포 안에 있음	특히 핵
검출 유전자가 늘어남	—
단일핵 시퀀싱에는 필수	핵에는 미성숙 RNA가 대부분

포함 여부에 따라 UMI 수가 20~30% 달라질 수 있습니다 — 자료를 합칠 때 맞춰야 해요.

나오는 폴더

pbmc_run1/
  _cmdline                     <- 무슨 명령을 썼는지
  outs/
    web_summary.html          <- 사람이 먼저 여는 것 (13강)
    metrics_summary.csv        <- 같은 숫자를 한 줄로
    filtered_feature_bc_matrix/ <- 세포로 인정된 것만 (11강)
    filtered_feature_bc_matrix.h5
    raw_feature_bc_matrix/     <- 빈 방울까지 전부
    raw_feature_bc_matrix.h5
    possorted_genome_bam.bam   <- 가장 크다. 수십 GB
    molecule_info.h5           <- UMI 하나하나의 기록
    analysis/                  <- 미리 돌려 둔 PCA · 군집 · UMAP
    cloupe.cloupe              <- Loupe Browser 용
    

실제 분석에서 매일 쓰는 것은 web_summary.html 과 filtered_feature_bc_matrix 둘뿐입니다. 나머지는 필요할 때만 엽니다.

High school출력물

파일	내용
filtered_feature_bc_matrix	세포로 판정된 것만 — 대개 이것을 씀
raw_feature_bc_matrix	모든 바코드 — 주변 RNA 보정에 필요
web_summary.html	13강 — 품질 요약
BAM	정렬 결과 — 크고 재분석용
molecule_info.h5	분자 수준 정보

두 번째 줄을 버리지 마세요 — 16강의 주변 RNA 보정에 필요합니다.

🤔 Check yourself

Cell Ranger 가 버리는 것 중 가장 많은 것은?

🤔 Check yourself

filtered_feature_bc_matrix 와 raw_feature_bc_matrix 의 차이는?