7강 / 20강

벤치 위의 하루 — 시료에서 라이브러리까지

아홉 단계와, 그중 되돌릴 수 없는 두 자리

실제로 손이 하는 일은 하루짜리입니다. 아래 표가 3′ v3.1 사용설명서의 흐름이고, 시간은 어림값이에요.

고등학생시료에서 라이브러리까지

단계	하는 일
1	조직을 세포로 흩기
2	죽은 세포·부스러기 제거
3	세포 수와 생존율 확인
4	적재 농도 계산 (8강)
5	칩에 올려 GEM 생성
6	역전사 (방울 안에서)
7	방울을 깨고 cDNA 회수
8	PCR 증폭
9	라이브러리 제작

시료 조건 — 여기가 제일 중요하다

항목	요구	못 지키면
세포 농도	700 ~ 1,200 개/µL	넣은 세포 수가 어긋나 이중체율이 흐트러진다
생존율	90% 이상	죽은 세포의 RNA 가 새어 나와 주변 RNA 가 된다 (16강)
덩어리	없어야 한다	칩 통로가 막힌다
부피	43.2 µL 이하	우물에 안 들어간다

생존율 90% 가 가장 자주 무너지는 조건입니다. 특히 조직을 효소로 해리한 시료에서요. 그리고 이것이 나중에 분석에서 가장 골치 아픈 문제(주변 RNA)로 돌아옵니다.

고등학생되돌릴 수 없는 두 자리

지점	왜 되돌릴 수 없나
세포 흩기 (1단계)	손실된 세포는 영영 없음 · 발현도 변함
GEM 생성 (5단계)	바코드가 붙는 순간 — 이중체도 확정

이 두 지점 뒤에는 계산으로 고칠 수 없는 것들이 정해집니다.

16강의 주변 RNA와 이중체가 5단계에서 생깁니다. 나중에 어느 정도 보정할 수 있지만 완전히는 안 돼요.

시간표를 눈으로 봅니다.

Python 브라우저에서 실행

# 하루가 어떻게 흘러가나
steps = [
    ("세포 현탁액 준비",            60, "되돌릴 수 없다"),
    ("GEM 생성 (Chromium)",        18, "되돌릴 수 없다"),
    ("GEM 안에서 역전사 53C 45min", 55, "되돌릴 수 없다"),
    ("GEM 깨기 · 정제",             45, "다시 할 수 있다"),
    ("cDNA 증폭 11~13 사이클",      45, "다시 할 수 있다"),
    ("조각내기 · 말단수선",          40, "다시 할 수 있다"),
    ("어댑터 결찰",                 30, "다시 할 수 있다"),
    ("시료 인덱스 PCR",             45, "다시 할 수 있다"),
    ("품질 확인",                   40, "-"),
]
total = 0
for name, mins, back in steps:
    total += mins
    mark = "X" if back == "되돌릴 수 없다" else " "
    print("%s %-30s %3d분  (누적 %3d분)" % (mark, name, mins, total))
print()
print("합계 %d분 = 약 %.1f시간" % (total, total / 60))
print("X 표시한 세 단계는 다시 할 수 없습니다 — 시료가 이미 쓰였으니까요.")

고등학생세포 흩기가 왜 중요한가

일어나는 일	결과
연약한 세포가 죽음	그 유형이 과소 대표
단단히 박힌 세포가 안 나옴	같음
스트레스 유전자 발현	인공적 신호
세포막이 손상됨	주변 RNA 증가 — 16강

단일세포 자료의 세포 구성은 조직의 구성이 아닙니다 — 흩기에서 살아남은 것들입니다.

중간에 멈춰도 되는 자리

하루를 통째로 비우기 어려우면 두 군데서 끊을 수 있습니다.

🧊

역전사 뒤

GEM 그대로 −20 °C
일주일까지

🧊

cDNA 증폭 뒤

정제한 cDNA
−20 °C 에서 보관

⛔

GEM 생성 중

여기서는 못 멈춥니다
유탁액이 깨집니다

고등학생품질 확인 지점

단계	확인	기준
흩은 뒤	생존율	80~90% 이상
흩은 뒤	덩어리 없음	여과 확인
cDNA 후	수율과 크기 분포	Bioanalyzer
라이브러리 후	농도와 크기	—

첫 줄이 가장 중요합니다 — 생존율이 낮으면 시작하지 말아야 합니다.

🤔 확인 문제

생존율 90% 를 못 지키면 나중에 무엇이 문제가 되나?

🤔 확인 문제

아홉 단계 중 되돌릴 수 없는 것은?