14강 / 20강

어디까지가 세포인가 — 무릎 그림

바코드 68만 개 중 2,700개만 남기는 판단

raw_feature_bc_matrix 에는 바코드가 수십만 개 들어 있습니다. 그런데 실제 세포는 수천 개뿐이에요. 나머지는 빈 방울입니다.

빈 방울에도 UMI 가 조금 잡힙니다 — 용액에 떠다니던 RNA 가 들어갔거든요. 그러니 UMI 가 0 이 아니다 로는 세포를 가릴 수 없습니다.

대신 이렇게 합니다. 바코드를 UMI 수가 많은 순으로 줄 세우고, 가로축을 순위, 세로축을 UMI 수로 놓고 그립니다. 둘 다 로그 눈금으로요.

고등학생어디까지가 세포인가

바코드는 680만 개 준비돼 있고, 실제 세포는 수천 개입니다. 나머지는 뭘까요?

바코드 유형	UMI 수
진짜 세포	많음 (수천~수만)
빈 방울	적음 (수십~수백) — 주변 RNA

빈 방울에도 UMI가 조금은 있습니다 — 용액에 떠다니던 RNA가 잡혀서요.

그림이 세 토막으로 보인다

🏔️

평평한 왼쪽

UMI 수천~수만.
진짜 세포

🧗

가파른 절벽

몇백 등 사이에
UMI 가 열 배 떨어진다

🏜️

긴 꼬리

UMI 열 개 안팎.
빈 방울

이 절벽이 무릎(knee) 입니다. 여기서 자르면 됩니다. 문제는 절벽이 늘 이렇게 뚜렷하지는 않다 는 것이에요.

고등학생무릎 그림

바코드를 UMI 수 순으로 줄 세워 그리면 무릎처럼 꺾인 곡선이 나옵니다.

구간	정체
왼쪽 평평한 부분	진짜 세포 — UMI가 많음
급격한 하강 (무릎)	경계
오른쪽 긴 꼬리	빈 방울

무릎이 뚜렷할수록 좋은 자료입니다 — 흐릿하면 세포 품질이 나쁩니다.

가로세로 둘 다 로그 눈금이어야 절벽이 보입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 무릎 그림을 그려 본다
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt
rng = np.random.default_rng(3)

# 진짜 세포 2,700개 — UMI 가 많다
cells = rng.lognormal(np.log(2200), 0.55, 2700)
# 빈 방울 60만 개 — 주변 RNA 만 조금
empty = rng.lognormal(np.log(9), 0.8, 600_000)

allbc = np.concatenate([cells, empty])
allbc = np.sort(allbc)[::-1]
rank = np.arange(1, len(allbc) + 1)

plt.figure(figsize=(7, 4.2))
plt.loglog(rank, allbc, lw=1.6)
plt.axvline(2700, color="crimson", ls="--", lw=1.4)
plt.text(2700 * 1.15, allbc.max() * 0.4, "2,700 cells", color="crimson", fontsize=9)
plt.xlabel("barcode rank")
plt.ylabel("UMI count")
plt.title("barcode rank plot (knee plot)")
plt.grid(alpha=.3, which="both")
plt.tight_layout()
plt.show()

고등학생Cell Ranger의 판정 방법

단계	내용
1	상위 바코드들의 UMI 중앙값을 구함
2	그 값의 일정 비율을 1차 문턱으로
3	문턱 근처의 바코드를 배경과 비교 (EmptyDrops 방식)
4	배경과 다른 것을 세포로 추가

단순히 문턱만 쓰면 UMI가 적은 진짜 세포를 놓칩니다 — 그래서 2단계 판정을 합니다.

이것이 EmptyDrops 가 하는 일의 뼈대입니다.

Python 브라우저에서 실행

# EmptyDrops 의 착상 — 양이 아니라 '조성' 을 본다
import numpy as np

genes = ["MALAT1", "B2M", "ACTB", "HBB", "PPBP", "CD3D"]

# 주변 RNA 의 조성 (빈 방울들을 다 합쳐서 얻는다)
soup = np.array([0.40, 0.22, 0.20, 0.10, 0.05, 0.03])

# UMI 가 똑같이 80개인 바코드 두 개
bc_a = np.array([33, 18, 16,  8,  4,  1])   # 주변 RNA 를 닮았다
bc_b = np.array([ 6,  9, 11,  2, 46,  6])   # PPBP 로 쏠려 있다 (혈소판!)

def surprise(obs, soup):
    p = obs / obs.sum()
    # 주변 RNA 조성에서 얼마나 벗어났나 (KL 발산)
    return float(np.sum(p * np.log((p + 1e-9) / soup)))

print("%-8s %5s  %s" % ("", "UMI", "  ".join("%7s" % g for g in genes)))
print("%-8s %5s  %s" % ("주변RNA", "-", "  ".join("%7.2f" % v for v in soup)))
print("%-8s %5d  %s" % ("바코드A", bc_a.sum(), "  ".join("%7d" % v for v in bc_a)))
print("%-8s %5d  %s" % ("바코드B", bc_b.sum(), "  ".join("%7d" % v for v in bc_b)))
print()
print("주변 RNA 와의 거리:  A %.3f   B %.3f" % (surprise(bc_a, soup), surprise(bc_b, soup)))
print()
print("UMI 수는 같지만 B 는 조성이 전혀 다릅니다 -> 진짜 세포로 살립니다.")
print("A 는 주변 RNA 를 그대로 닮았습니다 -> 빈 방울로 버립니다.")

고등학생판정이 어려운 경우

상황	문제
세포 크기 차이가 큼	작은 세포는 UMI가 적어 빈 방울처럼
주변 RNA가 많음	빈 방울의 UMI가 높아 경계가 흐림
세포 수가 예상과 다름	—
죽어 가는 세포	UMI가 적음

무릎 그림을 눈으로 확인하고, 필요하면 문턱을 손으로 조정합니다.

🤔 확인 문제

무릎 그림의 긴 꼬리 에 있는 바코드는 무엇인가?

🤔 확인 문제

EmptyDrops 가 UMI 수만 보지 않고 조성을 보는 이유는?