19강 / 20강

PBMC 한 시료를 처음부터 끝까지

【실습 종합】 10x 공개 자료 pbmc3k — 기계에서 세포유형까지

10x 가 2016년에 공개한 시료 하나를 따라갑니다. 단일세포 분석을 배우는 사람이라면 누구나 한 번은 거치는 자료예요.


시료	건강한 사람의 말초혈액 단핵세포 (PBMC)
키트	Chromium Single Cell 3′ v1
파이프라인	Cell Ranger 1.1.0
참조	hg19
결과 행렬	유전자 32,738 × 세포 2,700
0 아닌 칸	2,286,884 (전체의 2.59%)

고등학생처음부터 끝까지

pbmc3k는 10x가 공개한 유명한 예제 자료입니다. 사람 말초혈액 단핵세포 약 2,700개예요.

단계	하는 일	강
1	표 읽기	11·12강
2	품질 거르기	15강
3	정규화	17강
4	변동 유전자 선택	—
5	PCA · 이웃 · 군집화	18강
6	표지자로 세포유형 이름 붙이기	—

일곱 걸음

실험     PBMC 를 Chromium 에 넣는다              →  방울 10만 개
시퀀싱   R1 26글자 · R2 98글자                   →  FASTQ 두 짝
count    cellranger count --transcriptome=hg19   →  행렬 32,738 × 2,700
확인     web_summary.html 을 연다                →  숫자 열한 개
거르기   유전자 200~2,500 · 미토 5% 미만         →  세포 2,638 개
정규화   CP10K + log1p · 변동 큰 유전자 2,000개  →  PCA 10개
군집     이웃그래프 + Leiden(0.5)                →  군집 9 개
    

5번에서 62개 가 잘려 나갑니다. 2,700 − 2,638 = 62 예요.

고등학생변동 유전자 선택

3만 유전자를 다 쓰지 않습니다. 세포마다 크게 다른 유전자만 골라요.

이유	내용
모든 세포에서 같은 유전자	구분에 도움이 안 됨
노이즈만 있는 유전자	방해
계산 속도	2,000개면 충분

발현이 높으면 분산도 큽니다 — 그래서 발현 대비 분산이 큰 유전자를 고릅니다.

3~5단계. 실제 pbmc3k 는 2,700 -> 2,638 개가 됩니다.

Python 브라우저에서 실행

# 3~5단계를 흉내 내 본다 — 행렬 하나에서 거르기까지
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(19)

N_CELL, N_GENE = 2700, 2000
counts = np.zeros((N_CELL, N_GENE))

# 세포마다 잡히는 깊이가 다르다
depth = rng.lognormal(np.log(2200), 0.5, N_CELL)

# 세포유형 다섯 가지, 저마다 다른 유전자 묶음을 켠다
types = rng.choice(5, N_CELL, p=[.42, .22, .15, .13, .08])
for t in range(5):
    m = types == t
    counts[np.ix_(m, np.arange(t * 60, t * 60 + 60))] += 3.0
counts += rng.random((N_CELL, N_GENE)) * 0.4
counts = rng.poisson(counts / counts.sum(1, keepdims=True) * depth[:, None])

n_genes = (counts > 0).sum(1)
total   = counts.sum(1)

print("행렬:  세포 %d × 유전자 %d" % counts.shape)
print("0 아닌 칸:  %s개  (%.2f%%)"
      % (format(int((counts > 0).sum()), ","), (counts > 0).mean() * 100))
print("세포당 유전자 중앙값:  %d" % np.median(n_genes))
print("세포당 UMI 중앙값:     %d" % np.median(total))
print()
keep = (n_genes >= 200) & (n_genes <= 2500)
print("거르기 전 %d개 -> 거른 뒤 %d개" % (N_CELL, keep.sum()))

6~7단계. 여기까지가 논문 그림 한 장입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 6~7단계 — 정규화 · PCA · 군집
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt
rng = np.random.default_rng(19)

N_CELL, N_GENE = 1200, 400
types = rng.choice(4, N_CELL, p=[.45, .25, .20, .10])
X = rng.random((N_CELL, N_GENE)) * 0.4
for t in range(4):
    X[np.ix_(types == t, np.arange(t * 40, t * 40 + 40))] += 3.0
depth = rng.lognormal(np.log(2000), 0.5, N_CELL)
C = rng.poisson(X / X.sum(1, keepdims=True) * depth[:, None]).astype(float)

# 6. 정규화 -> 변동 큰 유전자 -> 표준화 -> PCA
cp10k = C / C.sum(1, keepdims=True) * 10_000
L = np.log1p(cp10k)
hvg = np.argsort(-L.var(0))[:200]
Z = L[:, hvg]
Z = (Z - Z.mean(0)) / (Z.std(0) + 1e-9)
U, S, Vt = np.linalg.svd(Z - Z.mean(0), full_matrices=False)
P = U[:, :10] * S[:10]

# 7. 군집 — k-means 로 간단히 (실제로는 Leiden)
def kmeans(P, k, iters=40, seed=0):
    r = np.random.default_rng(seed)
    ctr = P[r.choice(len(P), k, replace=False)]
    for _ in range(iters):
        d = ((P[:, None, :] - ctr[None]) ** 2).sum(2)
        lab = d.argmin(1)
        for j in range(k):
            if (lab == j).any():
                ctr[j] = P[lab == j].mean(0)
    return lab

lab = kmeans(P, 4, seed=1)
# Pyodide 는 32비트라 bincount 가 int64 배열을 거부한다 — 색인 자료형으로 맞춘다
print("군집 크기:", np.bincount(np.asarray(lab, dtype=np.intp)))
print("실제 유형:", np.bincount(np.asarray(types, dtype=np.intp)))
print()
tab = np.zeros((4, 4), dtype=int)
for a, b in zip(lab, types):
    tab[a, b] += 1
print("군집 × 실제유형 맞대보기")
print(tab)
print()
print("각 줄에 큰 값이 하나씩이면 잘 나뉜 것입니다.")

plt.figure(figsize=(5.2, 4.4))
plt.scatter(P[:, 0], P[:, 1], c=lab, s=8, cmap="tab10", alpha=.75)
plt.xlabel("PC1"); plt.ylabel("PC2"); plt.title("clusters in PC space")
plt.tight_layout(); plt.show()

고등학생표지자로 이름 붙이기

세포 유형	표지자
T세포	CD3D · CD3E
CD4 T세포	+ IL7R
CD8 T세포	+ CD8A
B세포	MS4A1 (CD20)
NK세포	GNLY · NKG7
단핵구	CD14 · LYZ
수지상세포	FCER1A
혈소판	PPBP

군집 번호는 알고리즘이 붙이고, 이름은 사람이 붙입니다.

군집에 이름 붙이기

군집은 번호로 나옵니다 — 0, 1, 2 … 아무 뜻이 없어요. 이름은 표지자 유전자로 붙입니다.

군집	표지자	세포유형	세포 수
0	IL7R, CCR7	순진 CD4 T세포	697
1	CD14, LYZ	CD14⁺ 단핵구	480
2	IL7R, S100A4	기억 CD4 T세포	483
3	MS4A1	B세포	344
4	CD8A	CD8 T세포	271
5	FCGR3A, MS4A7	FCGR3A⁺ 단핵구	162
6	GNLY, NKG7	NK세포	155
7	FCER1A, CST3	수지상세포	32
8	PPBP	혈소판	14

맨 아래 혈소판 14개 를 보세요. 세포 2,638개 중 14개 — 0.5% 입니다. 8강에서 말한 “드문 세포유형을 보려면 세포를 많이 넣어야 한다” 가 이런 뜻이에요. 500개만 잡았다면 혈소판은 두세 개, 군집이 되지 못했을 겁니다.

이름 붙이기는 자동이 아닙니다 — 사람이 아는 표지자를 대조해야 해요.

Python 브라우저에서 실행

# 표지자 유전자로 군집에 이름 붙이기
import numpy as np

clusters = ["0", "1", "2", "3", "4"]
genes = ["IL7R", "CD14", "LYZ", "MS4A1", "CD8A", "GNLY", "PPBP"]

# 군집 × 유전자 평균 발현 (log1p CP10K)
expr = np.array([
    [2.9, 0.1, 0.3, 0.1, 0.4, 0.2, 0.0],   # 0
    [0.2, 3.4, 4.1, 0.1, 0.1, 0.2, 0.1],   # 1
    [0.3, 0.1, 0.2, 3.1, 0.1, 0.1, 0.0],   # 2
    [0.6, 0.1, 0.2, 0.1, 2.8, 1.1, 0.0],   # 3
    [0.1, 0.2, 0.3, 0.1, 0.3, 0.2, 4.6],   # 4
])

NAMES = {"IL7R": "CD4 T세포", "CD14": "단핵구", "LYZ": "단핵구",
         "MS4A1": "B세포", "CD8A": "CD8 T세포", "GNLY": "NK세포",
         "PPBP": "혈소판"}

print("%-6s %-8s %-6s  %s" % ("군집", "표지자", "값", "이름"))
for i, c in enumerate(clusters):
    j = int(expr[i].argmax())
    print("%-6s %-8s %-6.1f  %s" % (c, genes[j], expr[i][j], NAMES[genes[j]]))
print()
print("표지자가 겹치면(단핵구의 CD14 와 LYZ) 여러 개를 함께 봅니다.")
print("어떤 군집도 뚜렷한 표지자가 없으면 이중체나 부서진 세포를 의심합니다.")

고등학생이름 붙이기의 판단

상황	대처
여러 표지자가 다 높음	이중체 의심 — 16강
알려진 표지자가 없음	미지 세포 · 또는 저품질
군집이 너무 잘게 쪼개짐	해상도를 낮춤
두 유형이 한 군집에	해상도를 올림

군집 수에 정답이 없습니다 — 표지자가 일관되게 나뉘는 해상도를 고릅니다.

자동 주석 도구도 있어요. 참조 자료와 비교해 이름을 붙이는데, 참조에 없는 세포는 못 찾습니다.

🤔 확인 문제

pbmc3k 에서 세포가 2,700 → 2,638 개로 준 것은 어느 단계인가?

🤔 확인 문제

혈소판 군집이 14개뿐인 것에서 무엇을 배우나?