Lesson 7 of 20
보정과 FMO — 새어 든 빛을 빼내기
겹침은 물리라 없앨 수 없다. 대신 계산으로 뺀다
5강에서 봤듯이 형광의 방출 스펙트럼은 넓어서 이웃 검출기까지 걸칩니다. PE 를 붙인 세포가 APC 검출기에서도 조금 밝게 읽혀요.
보정(compensation)은 그 새어 든 몫을 계산으로 빼는 일입니다.
1. 형광 하나만 붙인 대조 시료를 검출기마다 만든다 (단일염색 대조)
2. PE 만 붙인 시료가 APC 검출기에서 얼마나 읽히는지 잰다 → 새는 비율
3. 진짜 시료에서 그 비율만큼 빼 준다
APC참 = APC읽힘 − (새는 비율 × PE읽힘)
보정을 안 하면 PE 가 밝은 세포가 전부 APC 양성처럼 보입니다. 있지도 않은 세포 집단이 생기는 것이죠.
보정이 끝나도 남는 물음이 있습니다. "이 세포가 진짜 양성인가, 아니면 그냥 배경인가?"
여기에 답하는 것이 FMO(Fluorescence Minus One) 대조입니다.
무염색 대조
아무것도 안 붙임
세포 자체의 자가형광만 본다
다른 형광이 새어 드는 몫은 못 본다
세포 자체의 자가형광만 본다
다른 형광이 새어 드는 몫은 못 본다
FMO 대조
보려는 것 하나만 빼고 다 붙임
그 검출기가 읽는 값 = 순전히 배경
여기가 곧 양성/음성의 경계
그 검출기가 읽는 값 = 순전히 배경
여기가 곧 양성/음성의 경계
FMO 는 "다 넣었는데 이것만 뺐다" 는 시료입니다. 그 시료에서 읽히는 값이 곧 배경의 위쪽 끝이에요. 게이트를 거기에 긋습니다.
🤔 Check yourself
FMO 대조 시료는 어떻게 만들까요?
Answer 하나만 빼면, 그 검출기가 읽는 값은 다른 형광들이 새어 든 몫 + 자가형광 — 곧 순수한 배경입니다. 그 위가 진짜 양성이에요.