4강 / 20강

2만 개를 한 통에 넣고 흔든다

DepMap Avana 라이브러리 · 유전자당 안내 RNA 4개

유전자 하나를 끄고 세포가 죽는지 보는 실험은 어렵지 않습니다. 문제는 2만 번 해야 한다는 것입니다. 그것도 세포주마다요. 608개 세포주 × 1만 7천 개 유전자 = 1천만 번이 넘습니다.

접시 1천만 개를 놓을 수는 없습니다. 그래서 방법을 뒤집습니다. 접시 하나에 다 넣고, 나중에 누가 사라졌는지 셉니다.

고등학생2만 개를 한 통에 넣고 흔든다

유전자 하나씩 실험하면 2만 번을 해야 합니다. 대신 한 통에 다 섞어 넣고 한 번에 합니다.

단계	하는 일
1	유전자 2만 개를 겨냥하는 안내 RNA 라이브러리를 만듦
2	세포 집단에 세포당 하나씩 들어가게 감염
3	2~3주 배양
4	남은 세포에서 안내 RNA 서열을 읽어 수를 셈

필수 유전자를 끈 세포는 죽어 사라집니다 — 그 안내 RNA도 줄어듭니다.

순서

📚

1 · 라이브러리

유전자 하나마다 안내 RNA 를 4가지씩 만듭니다. 총 7만 5천 가지

🦠

2 · 감염

바이러스로 세포에 넣습니다. 세포 한 개에 안내 RNA 한 가지만 들어가게 묽게

🍲

3 · 배양

한 통에 섞어 3주쯤 기릅니다. 필요한 유전자가 꺼진 세포는 못 자랍니다

🔢

4 · 세기

처음과 끝에 안내 RNA 를 서열분석으로 셉니다. 줄어든 것이 답입니다

세포를 세지 않습니다. 안내 RNA 를 셉니다. 세포가 죽으면 그 세포가 갖고 있던 안내 RNA 도 통에서 사라지니까요. 이 바꿔치기가 이 방법의 전부입니다.

고등학생안내 RNA가 바코드 역할

세포 안에 "나는 X 유전자를 껐다"는 쪽지가 들어 있는 셈입니다. 그래서 섞어 놓고도 나중에 셀 수 있어요.

시점	안내 RNA 수
시작	거의 균등
2~3주 뒤 — 비필수 유전자	비슷하게 유지
2~3주 뒤 — 필수 유전자	확 줄어듦 (드롭아웃)

DepMap의 Avana 라이브러리는 유전자당 안내 RNA를 4개 씁니다. 하나가 실패해도 나머지가 확인해 주니까요.

필요한 유전자일수록 log2 배수변화가 아래로 내려갑니다. 이 값이 다음 강에서 '유전자 효과 점수' 로 바뀝니다.

Python 브라우저에서 실행

# 통 안에서 무슨 일이 일어나는지 아주 작게 흉내 내 봅니다.
import numpy as np

rng = np.random.default_rng(7)
n_genes = 6
start = np.full(n_genes, 1000)          # 처음엔 유전자마다 세포 1000개씩

# 이 세포주에서 각 유전자가 얼마나 필요한지 (0 = 필요없음, 1 = 반드시 필요)
need = np.array([0.0, 0.0, 0.1, 0.5, 0.9, 1.0])
names = ["쓸모없음", "쓸모없음", "조금", "꽤", "많이", "필수"]

grow = 2 ** 10                          # 3주 동안 열 번 분열한다고 치고
end = start * grow * (1 - need)
end = rng.poisson(np.maximum(end, 1))   # 세는 일에도 흔들림이 있습니다

print("유전자   필요도   처음    나중       log2 배수변화")
for i in range(n_genes):
    lfc = np.log2(end[i] / (start[i] * grow))
    print(names[i].ljust(8), str(need[i]).ljust(7), start[i], str(end[i]).ljust(9), round(lfc, 2))

이 방법에는 이름이 있습니다. 풀드 CRISPR 녹아웃 스크린(pooled CRISPR knockout screen). DepMap 이 쓰는 라이브러리는 Avana 이고, 유전자당 안내 RNA 4개, 총 7만 5천 가지쯤 됩니다.

여기서 나온 원자료는 안내 RNA 별 읽음 수입니다. 그것을 유전자별 점수로 바꾸는 데 계산이 한 겹 더 필요하고, 그게 다음 강입니다.

고등학생왜 안내 RNA를 여러 개 쓰나

안내 RNA 수	얻는 것
1개	싸다 · 실패하면 그 유전자를 통째로 잃음
4개	서로 확인 — 일치하면 신뢰

그런데 안내 RNA 하나하나가 다르게 행동할 수 있습니다.

문제	내용
효율 차이	어떤 것은 잘 자르고 어떤 것은 못 자름
오프타깃	다른 유전자도 자름
사본 수 효과	증폭된 구간을 자르면 DNA 손상만으로 세포가 죽음

마지막 줄이 CRISPR 스크린 특유의 함정입니다 — 유전자와 무관하게 죽습니다.

3천7백만 개. 안내 RNA 하나가 우연히 사라지는 일을 막으려면 이만큼 넉넉히 들고 가야 합니다.

Python 브라우저에서 실행

# 통 하나에 세포가 몇 개나 있어야 하나 — 대표성 계산.
n_sgrna = 75000          # Avana 라이브러리의 안내 RNA 가짓수
cov = 500                # 안내 RNA 하나당 세포 몇 개를 갖고 갈 것인가

cells = n_sgrna * cov
print("안내 RNA", format(n_sgrna, ","), "가지 x 커버리지", cov)
print("→ 통 하나에 필요한 세포", format(cells, ","), "개")
print()
# 실험 내내 이 배수를 지켜야 한다. 계대할 때마다 다시 확보해야 하므로.
for passages in [1, 3, 6]:
    print("계대", passages, "번이면 매번", format(cells, ","), "개씩 남겨야 한다")

'하나만 튐' 의 평균은 −0.5 쯤으로 끌려가지만 중앙값은 −0.1 근처에 남습니다. 넷을 함께 보는 이유입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 안내 RNA 넷이 서로 어긋나면 어떻게 되나.
import numpy as np

rng = np.random.default_rng(4)

def read(true_effect, offtarget=0.0):
    # 안내 RNA 하나가 재는 값 = 진짜 효과 + 엉뚱한 절단 + 잡음
    return true_effect + offtarget + rng.normal(0, 0.12)

print("사례          안내1    안내2    안내3    안내4     평균    중앙값")
for name, eff, off in [("깨끗함", -1.0, 0.0), ("하나만 튐", -0.1, 0.0)]:
    v = [read(eff) for _ in range(4)]
    if name == "하나만 튐":
        v[2] = read(eff, -1.6)          # 셋째 안내 RNA 가 엉뚱한 자리를 잘랐다
    print(name.ljust(12), " ".join(f"{x:7.2f}" for x in v),
          f"{np.mean(v):8.2f}{np.median(v):9.2f}")

고등학생11강의 문제가 실험대에서 나타나는 모습

2만 개를 한꺼번에 물어보면 우연히 걸리는 것이 반드시 생깁니다. 11강에서 통계로 다루는 문제인데, 실험대에서는 이렇게 나타나요.

실험대의 우연	내용
안내 RNA 수가 우연히 줄어듦	시퀀싱 표본 추출의 변동
세포 집단의 확률적 변동	병목 현상
일부 세포만 편집됨	편집 효율 차이

그래서 여러 안내 RNA와 여러 반복 실험으로 우연을 눌러야 합니다.

18강에서 이 한계로 되돌아옵니다 — 문턱을 어디에 긋느냐의 문제입니다.

🤔 확인 문제

풀드 CRISPR 스크린에서 실제로 세는 것은 무엇입니까?

🤔 확인 문제

유전자 하나에 안내 RNA 를 4가지씩 쓰는 이유는?