Lesson 6 of 20

이게 진짜 변이인가 — 빈도와 깊이

VAF 중앙값 0.23 · 읽기 깊이 중앙값 84번 · 39 표본 12,154줄

MAF 표의 한 줄은 '여기 변이가 있다' 고 주장합니다. 그 주장이 얼마나 센지는 tref·talt 두 열에 들어 있습니다.

VAF = talt ÷ (tref + talt)

변이 대립유전자 빈도(variant allele frequency)입니다. 그 자리를 100번 읽었는데 20번이 변이였다면 VAF 는 0.2 입니다.

High school이게 진짜 변이인가

MAF 에 적힌 변이가 다 진짜 일까? 시퀀싱 오류일 수도 있다.

두 가지 지표로 판단한다

지표	뜻	이 자료의 중앙값
VAF	변이 대립유전자 빈도	0.23
읽기 깊이	그 자리를 몇 번 읽었나	84번

VAF 가 무엇인가

VAF = 변이 read 수 ÷ 전체 read 수

그 자리를 84번 읽었는데 20번 에서 변이가 보이면 VAF 0.24.

VAF 는 그 변이를 가진 세포의 비율을 반영한다

VAF 중앙값이 0.23. 절반 아래입니다. 왜 그럴까요.

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import tmb

m = tmb.mut()
depth = m["tref"] + m["talt"]
v = m["talt"] / depth

print("변이", len(m), "줄")
print("읽기 깊이  중앙값", int(depth.median()), "· 1사분위", int(depth.quantile(.25)), "· 3사분위", int(depth.quantile(.75)))
print("VAF        중앙값", round(v.median(), 3), "· 1사분위", round(v.quantile(.25), 3), "· 3사분위", round(v.quantile(.75), 3))
print()
print("VAF 0.10 미만", int((v < .10).sum()), "줄 =", round(100 * (v < .10).mean(), 1), "%")

VAF 가 낮은 데는 이유가 셋 있습니다

🧪

종양 순도

떼어낸 조각에 정상 세포가 섞여 있다. 종양이 절반이면 VAF 도 절반으로 눌린다

🌱

하위 클론

종양 세포 일부만 가진 변이. 나중에 생긴 변이일수록 VAF 가 낮다

🎲

잡음

시퀀싱·정렬 오류. 얕게 읽힌 자리일수록 우연히 몇 번 잘못 읽히기 쉽다

앞의 둘은 진짜 변이입니다. 셋째는 가짜입니다. 그런데 표만 보고는 구분되지 않습니다.

High schoolVAF 0.23 이 뜻하는 것

순수한 암세포에서 한쪽 대립유전자 에만 변이가 있으면 VAF 가 0.5 여야 한다.

그런데 0.23 이다. 왜?

이유	내용
종양 순도	정상 세포가 섞임 — 가장 큰 요인
클론 구조	일부 암세포에만 있는 변이
복제수 변화	대립유전자 수가 다름

순도로 계산해 보면

종양 순도가 46% 면 VAF 가 0.23 이 된다 (0.46 × 0.5 = 0.23).

즉 이 조직의 절반 이하가 암세포 라는 뜻이다.

VAF 분포에서 종양 순도를 추정할 수 있다

VAF 0.10 을 걸면 중앙 TMB 가 6.77 에서 5.50 으로, 19% 내려갑니다. 39명 중 한 명이 문턱 아래로 내려옵니다.

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import tmb

# VAF 문턱을 세워 걸러 보면 TMB 가 얼마나 줄어드나
rows = []
for s in tmb.samples():
    d = tmb.mut(s)
    d = d[~d["type"].isin(tmb.SILENT)]
    v = d["talt"] / (d["tref"] + d["talt"])
    rows.append((len(d) / 30, (v >= .05).sum() / 30, (v >= .10).sum() / 30))

import statistics as st
for i, name in enumerate(["문턱 없음", "VAF ≥ 0.05", "VAF ≥ 0.10"]):
    print(f"{name:12s} 중앙 TMB {st.median([r[i] for r in rows]):6.2f}")
print()
print("문턱 없이 10 을 넘던 사람 중 VAF 0.10 필터로 내려온 사람:",
      sum(1 for r in rows if r[2] < 10 <= r[0]), "명 / 39명")

High school순도가 낮으면 변이를 놓친다

순도	기대 VAF	깊이 84 에서 변이 read
80%	0.40	약 34개
50%	0.25	약 21개
20%	0.10	약 8개
10%	0.05	약 4개

마지막 줄이 위험하다

변이 read 가 4개면 우연히 0개 가 될 수도 있고, 검출 도구가 잡음으로 판정 할 수도 있다.

그러면 실제로 있는 변이를 놓친다. 그리고 TMB 가 낮게 나온다.

그러니 순도가 TMB 에 영향을 준다

순도가 낮은 표본은 TMB 가 과소평가 된다. 그런데 순도는 조직을 어디서 잘랐느냐 에 달렸다.

TMB 가 낮은 것이 종양의 성질이 아니라 조직 채취의 결과일 수 있다

읽기 깊이도 함께 봐야 합니다. 20번 읽어서 3번 변이면 VAF 0.15 이지만, 200번 읽어서 30번 변이여도 VAF 0.15 입니다. 두 주장의 무게는 전혀 다릅니다.

3.7% 가 20번 미만입니다. 이 줄들도 TMB 에서는 다른 줄과 똑같이 1로 셉니다.

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import tmb

m = tmb.mut()
depth = m["tref"] + m["talt"]
shallow = m[depth < 20]

print("깊이 20번 미만으로 읽힌 변이", len(shallow), "줄 =", round(100 * len(shallow) / len(m), 1), "%")
print()
print(shallow[["gene", "protein", "tref", "talt"]].head(5).to_string(index=False))
print()
print("얕은 자리에서는 VAF 가 성글게 튄다 — 3/12, 2/9 처럼 분모가 작으니까.")

High school깊이가 정하는 검출 한계

깊이	검출 가능한 최소 VAF
50	약 5~10%
84	약 3~5%
500	약 1%

패널이 깊이 읽는 이유가 이것이다

유전자 패널은 범위가 좁은 대신 깊게 읽는다 — 500~1,000번.

그러면 낮은 VAF 변이도 잡을 수 있다. 순도가 낮은 시료에서 유리하다.

그런데 TMB 비교에는 문제가 된다

패널은 더 많이 찾고 전엑솜은 덜 찾는다. 같은 종양인데 TMB 가 다르게 나온다.

12강에서 이 문제를 정면으로 본다.

넓게 얕게 읽는 것과 좁게 깊게 읽는 것은 다른 변이 목록을 만든다

🤔 Check yourself

VAF 0.10 필터를 걸었더니 TMB 중앙값이 19% 내려갔다. 이때 함께 잘려 나간 것으로 볼 수 있는 것은?

🤔 Check yourself

같은 VAF 0.15 인 두 변이 중 더 믿을 만한 것은?