8강 / 20강

시료 준비 — 세포에서 RNA 를 꺼내기

여기서 부서진 RNA 는 뒤에서 되살릴 수 없다

이제 기계에서 벤치로 내려옵니다. 시퀀서에 넣을 라이브러리를 만들려면 먼저 RNA 가 있어야 해요.

RNA 는 다루기 까다롭습니다. 이유가 둘입니다.

① 스스로 끊어진다

리보스의 2′-OH 가
제 인산결합을 공격한다.
DNA 에는 없는 자리다

② RNase 가 어디에나 있다

손끝 · 침 · 먼지에 있고
끓여도 안 죽는다.
보조인자도 필요 없다

고등학생여기서 부서진 RNA는 되살릴 수 없다

RNA는 아주 약합니다. 그리고 분해하는 효소가 어디에나 있어요.

RNase가 있는 곳	대처
손·피부	장갑 · 자주 교체
침·호흡	마스크
실험대·기구	RNase 제거제
물·시약	RNase-free 제품

RNase는 고압멸균으로도 안 죽습니다 — 열에 강해요.

추출법 두 갈래

	페놀-클로로폼 (TRIzol)	실리카 컬럼 (RNeasy)
원리	산성에서 RNA 만 물층에 남는다	높은 염 농도에서 유리막에 붙는다
수율	높다	중간
작은 RNA	같이 나온다	대개 흘려버린다
순도	페놀이 남기 쉽다	깨끗하다
손이 가는 정도	많다 · 후드 필요	적다 · 30분
알맞은 곳	조직 · 지방 많은 시료 · miRNA	배양세포 · bulk RNA-seq

배양세포로 bulk RNA-seq 을 한다면 컬럼이 답입니다. 페놀 잔량이 다음 단계 효소를 죽이는 일이 잦거든요 (9강의 A260/A230).

고등학생시료를 얻는 순간이 중요하다

시간	일어나는 일
조직을 떼어 낸 직후	세포가 스트레스 반응 시작
몇 분	즉시 반응 유전자가 켜짐 — 인공 신호
수십 분	RNA 분해 시작

빨리 얼리거나 보존액에 넣는 것이 핵심입니다 — 시계가 돌기 시작했으니까요.

모든 시료를 같은 시간 안에 처리해야 합니다. 어떤 시료만 오래 걸리면 그것이 배치효과가 돼요.

오염은 고르게 얹히는데, 피해는 고르지 않습니다.

Python 브라우저에서 실행

# gDNA 오염이 카운트에 무엇을 하나
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(9)

n_gene = 8
gene = ["ACTB", "GAPDH", "CD3D", "MS4A1", "LYZ", "IL2", "FOXP3", "TNF"]
true_expr = np.array([9000, 8200, 400, 260, 1500, 12, 30, 45])

print("%-8s %10s %12s %12s" % ("유전자", "진짜", "gDNA 5%", "차이"))
for i, g in enumerate(gene):
    # gDNA 는 유전자 길이에 비례해 고르게 얹힌다 — 발현량과 무관하다
    noise = rng.poisson(60)
    print("%-8s %10d %12d %11.0f%%"
          % (g, true_expr[i], true_expr[i] + noise, noise / true_expr[i] * 100))
print()
print("많이 켜진 유전자는 거의 안 흔들립니다 (1% 미만).")
print("적게 켜진 유전자는 몇 배가 됩니다 — IL2 · FOXP3 를 보세요.")
print("드물게 발현되는 유전자를 보려던 실험이 여기서 무너집니다.")

고등학생추출 방법

방법	내용	특징
실리카 컬럼	염 농도로 붙였다 뗌	깨끗 · 편함 · 짧은 RNA 손실
페놀-클로로포름 (TRIzol)	상 분리	수율 높음 · 위험 · 잔류물
자성 비드	자석으로 회수	자동화에 유리

첫 줄의 "짧은 RNA 손실"이 중요합니다 — miRNA를 보려면 전용 키트가 필요해요.

얼마나 필요한가

시료	필요한 양	어림
배양세포	총 RNA 100 ng ~ 1 µg	세포 10만~50만 개
조직	같음	10~30 mg 조각
혈액	같음	PAXgene 튜브 2.5 mL

TruSeq Stranded mRNA 기준으로 100 ng 이면 만들 수 있고, 넉넉하게는 500 ng ~ 1 µg 을 씁니다. 양이 모자라면 PCR 사이클을 늘려야 하고, 그러면 중복 읽기가 늘어요 (14강).

고등학생DNase 처리

안 하면	결과
게놈 DNA가 섞임	정량이 부정확
—	인트론 영역에 read가 붙음
—	발현이 없는 유전자에서 신호

10강의 라이브러리 제작에서 DNA도 함께 처리됩니다 — 미리 없애야 해요.

🤔 확인 문제

RNA 가 DNA 보다 잘 끊어지는 구조상의 이유는?

🤔 확인 문제

DNase 처리를 빠뜨리면 나중에 어떤 값이 이상해지나?