10강 / 20강

전처리 — RNA 를 기계가 읽을 수 있는 모양으로

rRNA 를 어떻게 치울지, 그 하나가 나머지를 정한다

시퀀서는 RNA 를 못 읽습니다. 어댑터가 양끝에 붙은 짧은 DNA 조각만 읽어요. 그 모양으로 바꾸는 일이 라이브러리 제작입니다.

그런데 그 전에 해결할 것이 있습니다.

총 RNA 의 80~90% 가 리보솜 RNA (rRNA)

rRNA 는 세포 안에 어마어마하게 많습니다. 그리고 우리가 알고 싶은 것이 아니에요. 그대로 읽으면 읽기 열 개 중 아홉 개가 rRNA 입니다.

고등학생기계가 읽을 수 있는 모양으로

RNA를 그대로 넣을 수 없습니다. 여러 단계를 거쳐야 해요.

단계	하는 일
1	rRNA 제거 또는 mRNA 선택
2	RNA를 조각냄
3	cDNA 합성 (1·2가닥)
4	끝을 다듬고 A 하나 붙임
5	어댑터 붙이기
6	PCR 증폭
7	크기 선택과 정제

rRNA 를 치우는 두 방법

① polyA 선택 — 원하는 것만 잡는다

oligo-dT 자성비드가 mRNA 의 polyA 꼬리를 잡는다
나머지는 씻어 버린다
싸고 · 간단하고 · 깨끗하다
RIN ≥ 7 이어야 한다

② rRNA 제거 — 싫은 것만 뺀다

rRNA 에 붙는 프로브로 rRNA 만 없앤다
나머지는 전부 남는다
비싸다 · 부서진 RNA 도 된다
lncRNA · 전구체도 함께 본다

이럴 때	고를 것
배양세포 · 신선한 조직 · RIN ≥ 7	polyA 선택
FFPE · 오래된 시료 · RIN < 7	rRNA 제거
lncRNA · 전구체 mRNA 를 보고 싶다	rRNA 제거
세균 (polyA 가 아예 없다)	rRNA 제거 — 다른 선택이 없다

고등학생rRNA를 어떻게 치울까

세포 RNA의 80~90%가 리보솜 RNA입니다. 그냥 읽으면 대부분이 rRNA예요.

	polyA 선택	rRNA 제거
방법	polyA 꼬리를 낚음	rRNA에 붙는 미끼로 제거
잡는 것	성숙 mRNA	rRNA 뺀 모든 RNA
lncRNA	일부만	잘 잡음
분해된 RNA	취약	강함
비용	싸다	비싸다

"그 하나가 나머지를 정합니다" — 이 선택이 무엇을 볼 수 있는지를 결정해요.

rRNA 를 치우는 것은 취향이 아니라 돈 문제입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 읽기 100개가 어디로 가나
방식 = {
    "치우지 않음":  {"rRNA": 85, "mRNA": 12, "기타": 3},
    "polyA 선택":  {"rRNA": 3,  "mRNA": 93, "기타": 4},
    "rRNA 제거":   {"rRNA": 8,  "mRNA": 68, "기타": 24},
}
print("%-14s %8s %8s %8s   %s" % ("방식", "rRNA", "mRNA", "기타", "쓸모있는 읽기"))
for name, d in 방식.items():
    print("%-14s %7d%% %7d%% %7d%%   %d개"
          % (name, d["rRNA"], d["mRNA"], d["기타"], d["mRNA"]))
print()
need = 20_000_000
print("mRNA 읽기 %s쌍을 얻으려면 실제로 몇 쌍을 읽어야 하나" % format(need, ","))
for name, d in 방식.items():
    total = need / (d["mRNA"] / 100)
    print("  %-12s %16s쌍" % (name, format(int(total), ",")))
print()
print("rRNA 를 치우지 않으면 값이 여덟 배로 뜁니다.")

고등학생가닥 특이성 — dUTP 방법

RNA에는 방향이 있습니다. 어느 가닥에서 왔는지 알면 유용해요.

단계	내용
1가닥 cDNA	정상 염기
2가닥 cDNA	T 대신 U를 씀 (dUTP)
어댑터 붙인 뒤	U가 든 가닥을 분해
PCR	1가닥만 증폭됨

U로 표시해 두었다가 나중에 지웁니다 — 15강에서 이 방향 정보를 씁니다.

그다음 여섯 단계

	단계	하는 일	시간
1	단편화	94 °C 에서 8분 — 마그네슘이 RNA 를 200 nt 쯤으로 자른다	10분
2	1차 cDNA	무작위 프라이머로 역전사	30분
3	2차 cDNA	dTTP 대신 dUTP 를 넣는다 — 방향을 기억시킨다	60분
4	A 꼬리 붙이기	3′ 끝에 A 하나 — 어댑터의 T 와 맞물린다	30분
5	어댑터 결찰	양끝에 어댑터 + 인덱스 (11강)	30분
6	PCR 증폭	12~15 사이클 — 2차 가닥은 U 때문에 안 늘어난다	40분

합쳐서 하루입니다. 정제(비드 세척)가 사이사이에 네 번 들어가요.

투입량이 모자라면 읽기의 절반이 사본이 됩니다.

Python 브라우저에서 실행

# PCR 사이클을 몇 번 돌려야 하나
inputs = [(1000, 11), (500, 12), (250, 13), (100, 15), (25, 17)]

print("%12s %10s %14s" % ("투입 RNA(ng)", "사이클", "증폭 배수"))
for ng, cyc in inputs:
    print("%12d %10d %13s배" % (ng, cyc, format(2 ** cyc, ",")))
print()
print("투입량이 적을수록 사이클을 늘려야 합니다.")
print()
# 사이클이 늘면 중복 읽기가 는다
for ng, cyc in inputs:
    dup = min(0.05 * (2 ** (cyc - 11)), 0.85)
    print("투입 %4d ng -> %2d 사이클 -> 중복 읽기 약 %.0f%%" % (ng, cyc, dup * 100))
print()
print("중복 읽기는 같은 분자를 또 읽은 것이라 정보가 없습니다 (14강).")

고등학생왜 가닥 정보가 필요한가

쓰임	내용
겹치는 유전자 구분	양쪽 가닥에 유전자가 있을 때
안티센스 전사체	—
lncRNA	많은 lncRNA가 반대 가닥에
정확한 정량	read를 올바른 유전자에 배정

가닥 특이성이 없으면 유전자 10~20%의 정량이 부정확해집니다.

🤔 확인 문제

총 RNA 를 그대로 시퀀싱하면 안 되는 이유는?

🤔 확인 문제

2차 가닥에 dUTP 를 넣는 이유는?