Lesson 5 of 20

플로우셀 — 유리판 위에 가닥을 심는다

클러스터를 만드는 이유와, 너무 빽빽하면 생기는 일

플로우셀은 유리판 두 장 사이에 낸 아주 얇은 물길입니다. 시약이 이 길을 따라 흐르고, 위에서 현미경이 사진을 찍어요.

유리판 표면에는 짧은 DNA 가닥이 빽빽하게 심겨 있습니다. 라이브러리 조각의 어댑터가 여기에 달라붙어요. 그것이 시퀀싱의 출발점입니다.

그런데 가닥 하나는 형광 분자 하나짜리라 사진에 안 찍힙니다. 그래서 붙은 자리에서 그대로 불립니다.

High school유리판 위에 가닥을 심는다

플로우셀은 유리판입니다. 표면에 짧은 DNA 조각이 빽빽하게 붙어 있어요.

표면의 조각	역할
P5 · P7 어댑터	라이브러리의 양 끝과 짝을 이룸

라이브러리 가닥이 표면에 낚입니다 — 그리고 그 자리에서 증폭됩니다.

클러스터를 만드는 두 가지 방법

브리지 증폭 (예전 방식)

가닥이 다리처럼 휘어 옆의 프라이머를 잡고
복제하기를 되풀이한다.
점이 아무 데나 생긴다

ExAmp + 패턴 플로우셀 (지금)

유리판에 나노웰 을 미리 파 두었다.
먼저 들어온 조각이 우물 하나를 순식간에 차지한다.
점이 격자 위에 생긴다

패턴 플로우셀에서는 점의 자리가 이미 정해져 있습니다. 그래서 훨씬 빽빽하게 심을 수 있고, 사진 분석도 쉬워요. NextSeq 1000/2000 과 NovaSeq 이 이 방식입니다.

High school왜 클러스터를 만드나

가닥 하나의 형광은 너무 약해서 안 보입니다. 그래서 같은 자리에서 복제해 수천 벌로 만들어요.

단계	내용
한 가닥이 표면에 붙음	—
다리 증폭 (bridge amplification)	휘어져 옆의 어댑터에 붙고 복제
반복	같은 자리에 수천 벌의 복사본
한쪽 가닥 제거	모두 같은 방향이 되게

클러스터 하나가 read 하나가 됩니다 — 수천 벌이 함께 빛나 보이는 신호입니다.

가닥 하나를 점 하나로 키우는 셈.

Python Runs in your browser

# 클러스터 하나가 몇 개의 사본으로 되어 있나
import math

bridge_cycles = 35              # 브리지 증폭 사이클
copies = 2 ** bridge_cycles
print("이론상 사본 수:  2^%d = %s" % (bridge_cycles, format(copies, ",")))
print("실제 클러스터:   약 1,000 ~ 2,000 사본")
print("  -> 자리가 좁아서 금방 포화합니다.")
print()

# 점 하나의 크기와 밀도
spot_um = 1.0                   # 클러스터 지름 (um)
area_mm2 = 1.0
per_mm2 = 4_000_000             # 패턴 플로우셀의 나노웰 밀도 (어림값)
print("1 mm^2 에 나노웰 %s개" % format(per_mm2, ","))
print("나노웰 하나의 몫: %.2f um^2  (지름 %.2f um 원)"
      % (1e6 / per_mm2, 2 * math.sqrt(1e6 / per_mm2 / math.pi)))
print()
print("점이 이만큼 작아야 4억 개를 한 판에 올릴 수 있습니다.")

레인 · 타일 · 좌표

플로우셀은 칸으로 나뉘어 있습니다. 이 이름들이 나중에 FASTQ 의 첫 줄에 그대로 나와요 (13강).

단위	무엇	NextSeq P2 에서
레인(lane)	따로 흐르는 물길	1개 — 시료를 미리 섞어 넣는다
표면(surface)	위쪽 유리 · 아래쪽 유리	2면
타일(tile)	사진 한 장이 담는 네모	수백 장
좌표(X, Y)	타일 안 점의 자리	클러스터마다 하나

NovaSeq 은 레인이 2~4개라 레인마다 다른 시료 묶음을 넣을 수 있습니다. NextSeq 은 레인이 하나라 반드시 미리 섞어야 해요 (11강).

High school너무 빽빽하면

클러스터 밀도	결과
너무 낮음	read 수가 적음 — 낭비
적절	—
너무 높음	클러스터가 겹침 — 신호가 섞여 판독 불가

겹친 클러스터는 버려집니다 — 밀도가 너무 높으면 오히려 read가 줄어요.

그래서 라이브러리 농도를 정확히 재는 것이 중요합니다. 9강의 정량이 여기서 쓰여요.

과다 로딩이 왜 손해인지 — 푸아송 하나로 나옵니다.

Python Runs in your browser

# 로딩 농도와 %PF 의 맞바꿈
import math

wells = 100.0                   # 나노웰 100개로 줄여서 본다
print("%10s %12s %12s %12s" % ("넣은 조각", "찬 우물", "%PF", "쓸 수 있는 읽기"))
for loaded in [30, 60, 100, 150, 220, 320]:
    lam = loaded / wells
    p0 = math.exp(-lam)         # 빈 우물
    p1 = lam * p0               # 딱 하나
    occupied = 1 - p0
    pf = p1 / occupied if occupied else 0
    usable = wells * p1
    print("%10d %11.0f개 %11.0f%% %11.0f개"
          % (loaded, occupied * wells, pf * 100, usable))
print()
print("쓸 수 있는 읽기는 어느 지점에서 최대가 되고, 그 뒤로는 줄어듭니다.")
print("장비마다 권장 로딩 농도가 정해져 있는 이유입니다 (P2 는 650 pM).")

High school패턴화 플로우셀

최신 장비는 표면에 미리 파인 우물이 있습니다.

	무작위	패턴화
클러스터 위치	아무 데나	정해진 우물
밀도	확률에 의존	최대
겹침	있음	거의 없음
문제	—	한 우물에 둘 — 중복 클러스터

패턴화 플로우셀에서는 광학 중복이라는 새 문제가 생깁니다 — 같은 분자가 두 우물에.

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라이브러리를 권장량보다 많이 넣으면?