Lesson 9 of 20

시료 품질검사 — 세 대의 기계가 다른 것을 잰다

【실습】 NanoDrop · Qubit · Bioanalyzer 를 갈라 쓴다

추출한 RNA 를 그대로 라이브러리 제작에 넣으면 안 됩니다. 먼저 세 가지를 확인해요.

💧

얼마나 있나

농도
Qubit

🧼

깨끗한가

순도
NanoDrop

🧩

온전한가

완결성
Bioanalyzer

셋 다 필요합니다. 하나로는 답이 안 나와요.

High school세 대의 기계가 다른 것을 잰다

기계	재는 것	알려 주는 것
NanoDrop	흡광도	농도 + 순도
Qubit	형광	정확한 농도
Bioanalyzer	전기영동	완전성 (RIN)

셋이 다른 질문에 답합니다 — 하나로는 부족합니다.

세 기계가 재는 것

	NanoDrop	Qubit	Bioanalyzer
원리	빛 흡수(260 nm)	형광 염료	미세 전기영동
재는 것	핵산 비슷한 것 전부	RNA 만	조각 길이 분포
쓰는 양	1 µL	1~20 µL	1 µL
믿을 값	순도만	농도	RIN · DV200
걸리는 시간	10초	3분	30분

NanoDrop 의 농도는 믿지 않습니다. DNA·유리뉴클레오타이드·페놀도 260 nm 를 먹기 때문에 RNA 만 있는 것처럼 높게 나와요. 농도는 Qubit 으로 다시 잽니다.

High schoolNanoDrop — 순도를 본다

비율	보는 것	좋은 값
A260/280	단백질 오염	RNA 약 2.0
A260/230	염·페놀·구아니딘	2.0~2.2

농도는 부정확하지만 순도 정보는 여기서만 얻습니다.

A260/230이 낮으면 추출 시약이 남아 있는 겁니다. 다음 반응(역전사·PCR)이 억제될 수 있어요.

그래서 농도는 Qubit 으로 다시 잽니다.

Python Runs in your browser

# NanoDrop 이 왜 농도를 부풀리나
# 260 nm 를 먹는 것들 (기여도 어림)
contrib = {
    "RNA":            120.0,     # 진짜 RNA (ng/uL)
    "gDNA":            18.0,
    "유리 뉴클레오타이드":  22.0,
    "페놀 잔량":         15.0,
}
total = sum(contrib.values())

print("%-18s %10s %10s" % ("260 nm 를 먹는 것", "ng/uL", "몫"))
for k, v in contrib.items():
    print("%-18s %9.0f %9.0f%%" % (k, v, v / total * 100))
print("%-18s %9.0f" % ("-" * 12, total))
print()
print("NanoDrop 이 읽는 값:  %.0f ng/uL" % total)
print("Qubit 이 읽는 값:    %.0f ng/uL  (RNA 만)" % contrib["RNA"])
print()
over = (total - contrib["RNA"]) / contrib["RNA"] * 100
print("NanoDrop 은 %.0f%% 부풀려 읽었습니다." % over)
print("이 값으로 투입량을 맞추면 실제로는 절반만 넣은 셈이 됩니다.")

High schoolQubit — 정확한 농도

	NanoDrop	Qubit
원리	260 nm 흡수	결합해야 빛나는 염료
특이성	낮음 — DNA·RNA·뉴클레오타이드 다 흡수	높음 — RNA만
감도	낮음	높음
필요 시료	1~2 µl	1 µl

라이브러리 정량은 반드시 Qubit으로 — 5강의 클러스터 밀도가 여기에 달려 있습니다.

RIN — RNA 가 얼마나 온전한가

Bioanalyzer 는 RNA 를 길이순으로 늘어놓습니다. 온전한 시료라면 봉우리 두 개가 뚜렷해요 — 리보솜 RNA 인 18S 와 28S 입니다.

RIN 9~10

28S 봉우리가 18S 의 두 배
사이가 평평하다
무엇이든 만들 수 있다

RIN 3~5

봉우리가 뭉개졌다
짧은 쪽에 산이 생긴다
polyA 선택이 안 된다

RIN	쓸 수 있는 라이브러리
≥ 7	polyA 선택 (TruSeq Stranded mRNA) — 표준
4 ~ 7	rRNA 제거 로 바꾼다 (Ribo-Zero Plus)
< 4	RIN 은 의미를 잃는다 → DV200 으로 판단

RIN 이 무너진 자리에서 DV200 이 대신 판단합니다.

Python Runs in your browser

# DV200 — 부서진 시료에서 쓰는 잣대
import numpy as np

# 조각 길이 분포를 만들어 본다 (nt)
rng = np.random.default_rng(2)
good = rng.lognormal(np.log(1800), 0.7, 20000)     # 온전한 시료
bad  = rng.lognormal(np.log(180),  0.9, 20000)     # 심하게 부서진 시료

def dv200(x):
    return (x > 200).mean() * 100

print("%-12s %12s %14s" % ("시료", "중앙 길이", "DV200"))
for name, x in [("온전함", good), ("부서짐", bad)]:
    print("%-12s %10.0f nt %12.0f%%" % (name, np.median(x), dv200(x)))
print()
print("DV200 = 200 nt 보다 긴 조각의 비율입니다.")
print("Illumina 의 FFPE 지침은 DV200 > 30%% 를 문턱으로 씁니다.")
print()
for name, x in [("온전함", good), ("부서짐", bad)]:
    ok = "쓸 수 있다" if dv200(x) > 30 else "쓸 수 없다"
    print("%-12s -> %s" % (name, ok))

High schoolBioanalyzer — RIN

RNA 완전성 지수(RNA Integrity Number)는 1~10으로 표시됩니다.

RIN	상태	쓸 수 있나
9~10	온전함	모든 용도
7~8	약간 분해	대부분 가능
5~6	분해	제한적 — 3′ 치우침 (16강)
<5	심하게 분해	다시 추출 권장

RIN은 18S와 28S 리보솜 RNA 봉우리의 모양으로 계산됩니다.

FFPE 시료는 RIN이 원래 낮아요(2~3). 그래서 별도 지표(DV200)를 씁니다.

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