Lesson 14 of 20

읽기 품질검사 — 무엇을 자르고 무엇을 남기나

FastQC 의 빨간 X 가 늘 나쁜 것은 아니다

FASTQ 를 받으면 정렬하기 전에 한 번 훑어봅니다. FastQC 가 표준 도구예요. 명령 한 줄입니다.

fastqc Ctrl_1_S3_L001_R1_001.fastq.gz -o qc/

HTML 보고서가 나오고, 항목마다 ✅ ⚠️ ❌ 가 붙습니다. 문제는 RNA-seq 에서는 몇 항목이 원래 빨갛다 는 것이에요.

High school무엇을 자르고 무엇을 남기나

FastQC 같은 도구가 read 품질을 요약해 줍니다. 여러 항목이 있어요.

항목	보는 것
사이클별 품질	뒤로 갈수록 나빠지나 (3강)
염기 조성	ACGT 비율이 균일한가
GC 분포	이상한 봉우리가 있나
어댑터 함량	어댑터가 섞였나
중복 수준	같은 서열이 반복되나

항목별로 어떻게 볼 것인가

항목	빨간색이면	RNA-seq 에서
Per base sequence quality	뒤쪽 글자가 나쁘다	진짜 문제 — 잘라야 한다
Adapter content	어댑터가 읽혔다	진짜 문제 — 조각이 짧았다
Per base sequence content	앞 10~12글자가 치우쳤다	정상 — 무작위 프라이머 탓
Sequence Duplication Levels	같은 서열이 많다	대개 정상 — 많이 켜진 유전자다
Overrepresented sequences	한 서열이 유난히 많다	rRNA·미토콘드리아면 정상
Per sequence GC content	봉우리가 둘	오염 의심 — 확인할 것

High school빨간 X가 늘 나쁜 것은 아니다

FastQC는 일반 유전체를 기준으로 만들어졌습니다. RNA-seq은 정상적으로 여러 항목이 빨갛게 나와요.

항목	RNA-seq에서
중복 수준 높음	정상 — 발현 높은 유전자가 많이 읽힘
염기 조성 불균일 (앞부분)	정상 — 무작위 프라이머 편향
GC 분포에 봉우리	rRNA 잔량일 수도 — 확인 필요
과대표현 서열	고발현 유전자 — 정상

빨간 X를 기계적으로 고치려 하면 자료를 망칩니다.

중복 제거가 RNA-seq 에서 해로운 이유.

Python Runs in your browser

# 중복 읽기를 지우면 무슨 일이 생기나
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(6)

# 유전자 다섯 개, 진짜 발현량이 크게 다르다
genes = ["ACTB", "GAPDH", "CD3D", "IL2", "FOXP3"]
true = np.array([50000, 42000, 900, 40, 25])

# 정렬 자리는 유전자 길이 안에서 무작위 — 많이 읽힌 유전자는 자리가 겹친다
sites = 1200                       # 유전자 하나가 가질 수 있는 시작 자리 수
print("%-8s %10s %12s %10s" % ("유전자", "진짜 읽기", "중복제거 후", "잃은 비율"))
for g, n in zip(genes, true):
    # 서로 다른 자리가 몇 개나 채워지나 (쿠폰 수집가 문제)
    uniq = sites * (1 - np.exp(-n / sites))
    print("%-8s %10d %12.0f %9.0f%%" % (g, n, uniq, (1 - uniq / n) * 100))
print()
print("많이 켜진 유전자일수록 더 많이 깎입니다.")
print("발현량의 차이가 통째로 뭉개집니다 — 그래서 지우지 않습니다.")

High school무엇을 잘라야 하나

자를 것	왜
어댑터 서열	삽입물이 짧으면 read 끝에 딸려 옴 — 정렬 실패
저품질 끝부분	3강 — 위상 어긋남
polyG 꼬리	4강 — 2색 장비의 인공물
너무 짧아진 read	정렬이 모호해짐

과도한 트리밍은 오히려 나쁩니다 — 정렬 도구가 알아서 무시하기도 하니까요.

트리밍 — 자를 것은 둘뿐

① 어댑터

조각이 읽기보다 짧으면
끝까지 읽고 어댑터로 넘어간다
TruSeq: AGATCGGAAGAGC

② 품질 낮은 끝

사이클이 갈수록 위상이 어긋나
뒤쪽 글자가 흐려진다
2색 화학에서는 GGGG…

fastp -i R1.fastq.gz -I R2.fastq.gz \
      -o R1.trim.gz -O R2.trim.gz \
      --detect_adapter_for_pe \
      --trim_poly_g \
      --length_required 36 \
      -h fastp.html
    

--trim_poly_g 가 2색·1색 화학에서 꼭 필요합니다 (4강).

최소 길이 36 이라는 관습이 어디서 왔나.

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# 읽기가 짧아지면 어디에 붙는지 모르게 된다
import math

genome = 3.1e9                    # 사람 유전체 크기
print("%8s %18s %16s" % ("읽기 길이", "우연히 같은 서열이", "정렬 가능"))
for L in [20, 25, 30, 50, 75, 100]:
    # 무작위 서열이라면 4^L 가지 — 유전체 안에서 겹칠 기대 횟수
    expected = genome / (4 ** L)
    ok = "어렵다" if expected > 0.1 else "된다"
    print("%8d %18.2e %16s" % (L, expected, ok))
print()
print("30글자쯤부터 자리가 하나로 정해집니다.")
print("그래서 트리밍 뒤 최소 길이를 보통 36 으로 잡습니다.")
print()
print("다만 이것은 무작위 서열일 때의 셈입니다.")
print("실제 유전체에는 반복서열이 있어서 100글자도 여러 자리에 붙는 곳이 있습니다.")

High school트리밍의 균형

너무 세게 자르면	너무 약하게 자르면
read가 짧아져 다중 정렬 증가	어댑터 때문에 정렬 실패
정보 손실	품질 나쁜 염기로 잘못된 변이
정렬률이 오히려 떨어질 수도	—

발현 정량에는 가벼운 트리밍이면 충분합니다 — 변이 분석에는 더 신중해야 해요.

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