11강 / 20강

인덱스와 풀링 — 열두 시료를 한 통에 섞는다

그리고 인덱스 호핑이 그 통에서 시료를 바꿔치기하는 법

NextSeq 은 레인이 하나입니다. 시료 열둘을 돌리려면 한 통에 섞어서 넣는 수밖에 없어요.

섞은 뒤에 다시 가르려면 조각마다 어느 시료에서 왔는지가 적혀 있어야 합니다. 그것이 인덱스(index) 입니다. 어댑터에 함께 붙어 있어요.

5′— [P5] — [i5 인덱스] — [Read1 프라이머] — cDNA — [Read2 프라이머] — [i7 인덱스] — [P7] —3′
    

인덱스는 양쪽에 하나씩, 보통 8글자씩입니다. 시퀀서가 이것을 따로 읽어요 (3강의 사이클 나누기).

고등학생열두 시료를 한 통에 섞는다

플로우셀 하나에 시료 하나만 넣으면 낭비입니다. 여러 시료를 섞어 넣어요.

단계	내용
1	시료마다 다른 인덱스를 붙임
2	농도를 맞춰 섞음 (풀링)
3	한 번에 시퀀싱
4	인덱스로 다시 나눔 (디멀티플렉싱)

인덱스는 시료의 이름표입니다 — 어댑터에 들어 있어요.

고등학생단일 인덱스와 이중 인덱스

	단일 인덱스	이중 인덱스
인덱스 수	한쪽 어댑터에 1개	양쪽에 각각 1개
구분 가능 시료	인덱스 수만큼	조합만큼 — 훨씬 많음
호핑 방어	약함	강함

이중 인덱스는 둘 다 맞아야 그 시료로 인정합니다 — 그래서 안전합니다.

인덱스 호핑 — 이름표가 갈아탄다

풀 안에는 붙지 못하고 떠도는 어댑터가 조금씩 남아 있습니다. ExAmp 클러스터 생성 중에 이 자유 어댑터가 다른 시료의 조각에 붙어 버립니다.

A시료 조각 + B시료 인덱스 → B시료의 읽기로 기록된다

	비율	왜
예전 플로우셀 (브리지 증폭)	< 0.1%	자유 어댑터가 씻겨 나간다
패턴 플로우셀 (ExAmp)	0.1 ~ 2%	ExAmp 가 너무 빨라서 씻기 전에 붙는다

호핑은 절대량이 아니라 '옆 시료가 얼마나 센가' 로 정해집니다.

Python 브라우저에서 실행

# 호핑률이 낮게 발현되는 유전자에 무슨 일을 하나
hop = 0.01                  # 호핑률 1%
n_sample = 12

# A 시료: 이 유전자를 안 켠다. B 시료: 아주 세게 켠다
a_true, b_true = 0, 40000
others = (n_sample - 2) * 0    # 나머지 시료도 안 켠다

# B 의 읽기 중 hop 비율이 다른 시료로 흩어진다
leak_total = b_true * hop
leak_each = leak_total / (n_sample - 1)

print("B 시료의 이 유전자 읽기:      %s" % format(b_true, ","))
print("호핑률 %.0f%% 로 새어 나가는 양: %s" % (hop * 100, format(int(leak_total), ",")))
print("시료 하나가 받는 몫:          %s" % format(int(leak_each), ","))
print()
print("A 시료의 진짜 값:  %d" % a_true)
print("A 시료의 관측값:   %d" % int(leak_each))
print()
print("A 는 이 유전자를 켠 적이 없는데 %d 개가 찍힙니다." % int(leak_each))
print("발현량이 큰 유전자 옆에서, 발현이 없는 시료가 가장 크게 다칩니다.")

고등학생인덱스 호핑

시료를 섞으면 인덱스가 바뀌는 일이 생깁니다. 그러면 read가 엉뚱한 시료로 배정돼요.

원인	내용
자유 어댑터	정제가 부족해 남은 어댑터가 다른 가닥에 붙음
패턴화 플로우셀	ExAmp 화학에서 더 잘 일어남

비율은 0.1~2% 정도지만, 드문 변이를 볼 때는 치명적입니다.

풀링 — 몰농도를 맞춘다

시료를 같은 부피씩 섞으면 안 됩니다. 같은 분자 수씩 섞어야 해요. 그래서 농도(ng/µL)를 몰농도(nM)로 바꿉니다.

nM = (ng/µL) ÷ (660 × 평균 길이 bp) × 10⁶

평균 길이는 Bioanalyzer 나 TapeStation 으로 잽니다. 라이브러리는 보통 300~350 bp 근처에 봉우리가 하나 서요.

이 셈을 건너뛰면 시료마다 깊이가 몇 배씩 어긋납니다.

Python 브라우저에서 실행

# 라이브러리 몰농도 셈과 풀링
libs = [("A", 12.4, 320), ("B", 8.1, 335), ("C", 21.0, 310), ("D", 5.2, 345)]

def nM(ng_per_ul, bp):
    return ng_per_ul / (660.0 * bp) * 1e6

print("%-4s %10s %8s %10s" % ("시료", "ng/uL", "bp", "nM"))
rows = []
for name, ng, bp in libs:
    m = nM(ng, bp)
    rows.append((name, m))
    print("%-4s %10.1f %8d %10.1f" % (name, ng, bp, m))
print()

target = 4.0                 # 풀에 넣을 시료당 목표 nM
vol_total = 10.0             # 시료 하나당 최종 부피 (uL)
print("시료마다 %.1f nM 를 %.1f uL 만들려면:" % (target, vol_total))
for name, m in rows:
    v = target * vol_total / m
    print("  %s: 원액 %5.2f uL + 완충액 %5.2f uL" % (name, v, vol_total - v))
print()
print("부피를 같게 넣으면 C 가 D 보다 네 배 많은 읽기를 가져갑니다.")

고등학생호핑을 막는 법

방법	내용
고유 이중 인덱스 (UDI)	조합을 정해진 쌍으로만 씀 — 가장 효과적
철저한 정제	자유 어댑터 제거
풀 직전에 섞기	보관 중 호핑 방지
인덱스 거리 확보	서로 여러 글자 다르게

UDI를 쓰면 호핑된 read를 걸러 낼 수 있습니다 — 조합이 안 맞으니까요.

조합 인덱스(CDI)를 쓰면 조합 수는 많지만 호핑을 못 잡습니다. 목적에 따라 골라야 해요.

🤔 확인 문제

패턴 플로우셀에서 고유형 인덱스(UDI)를 써야 하는 이유는?

🤔 확인 문제

시료를 풀링할 때 같은 부피가 아니라 같은 몰농도로 섞는 이유는?