13강 / 20강

FASTQ — 네 줄이 읽기 하나

【실습】 이름줄과 품질줄을 손으로 뜯는다

BCL 을 FASTQ 로 바꾸는 프로그램이 BCL Convert 입니다 (예전 이름은 bcl2fastq). 하는 일은 셋이에요.

	하는 일
1	사이클별 파일을 클러스터별 서열로 뒤집는다 (12강)
2	인덱스를 읽어 시료별로 파일을 가른다 (11강)
3	서열과 품질을 네 줄 형식으로 적는다

NextSeq 1000/2000 은 이 일을 기계 안에서 합니다 (DRAGEN 칩). 런이 끝나면 FASTQ 가 바로 나와요.

고등학생네 줄이 읽기 하나

줄	내용	시작
1	read 이름과 정보	@
2	염기 서열	—
3	구분선	+
4	품질 점수	—

2번 줄과 4번 줄은 길이가 같아야 합니다 — 염기마다 점수 하나씩.

파일 이름 규칙

Ctrl_1_S3_L001_R1_001.fastq.gz
   │      │     │     └── R1 · R2 · I1 · I2
   │      │     └──────── 레인 번호
   │      └────────────── 시료시트에서 몇 번째 줄인가
   └───────────────────── 시료 이름 (시료시트에 적은 그대로)
    

토막	어디서 오나	주의
시료 이름	SampleSheet.csv	공백·한글을 쓰면 뒤에서 깨진다
`S3`	시료시트의 줄 순서	시료 이름이 아니다
`L001`	레인	NextSeq 은 늘 L001
`001`	파일 조각 번호	지금은 늘 001

고등학생이름줄을 뜯어보면

이름줄에는 read의 출처 정보가 콜론으로 구분돼 들어 있습니다.

항목	뜻
기기 ID	어느 장비
실행 번호	몇 번째 실행
플로우셀 ID	—
레인	플로우셀의 어느 줄
타일	레인 안의 구역
X · Y 좌표	클러스터의 위치
read 번호 (1/2)	양말단 중 어느 쪽
인덱스 서열	어느 시료

좌표가 있어서 광학 중복을 판별할 수 있습니다 — 5강의 문제입니다.

이름줄에 5강의 레인·타일·좌표가 그대로 들어 있습니다.

Python 브라우저에서 실행

# FASTQ 네 줄을 손으로 뜯는다
record = [
    "@VH00123:45:AAF7HJKM5:1:1101:24578:1000 1:N:0:ATTCAGAA+GGCTCTGA",
    "GTCAGGCTAAGGATCCATGGTCAGCTAGGATCCGATCAGGCTAAGGTTCCAAGCTAGGCTAAG",
    "+",
    "FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFFFFFFFFFF#F",
]
name, seq, plus, qual = record

print("1줄 (이름):", name[:52], "...")
head, tail = name.split(" ")
parts = head[1:].split(":")
labels = ["기계 이름", "런 번호", "플로우셀 ID", "레인", "타일", "X 좌표", "Y 좌표"]
for lab, v in zip(labels, parts):
    print("    %-12s %s" % (lab, v))
r, filt, ctrl, idx = tail.split(":")
print("    %-12s %s  (1=R1, 2=R2)" % ("읽기 번호", r))
print("    %-12s %s  (Y 면 품질 미달 — 보통 걸러져 있다)" % ("필터", filt))
print("    %-12s %s" % ("인덱스", idx))
print()
print("2줄 (서열):  %d글자" % len(seq))
print("4줄 (품질):  %d글자   <- 서열과 길이가 같아야 한다" % len(qual))
print("    길이가 같은가:", len(seq) == len(qual))

고등학생품질줄을 읽는 법

Q점수를 문자 하나로 적습니다. 크기를 줄이려고요.

문자 = chr(Q + 33) — Phred+33 인코딩

Q	문자	정확도
10	+	90%
20	5	99%
30	?	99.9%
40	I	99.99%

최신 장비는 Q점수를 몇 단계로 뭉쳐 저장하기도 합니다. 파일 크기를 크게 줄여요.

이 파일에는 품질값이 네 가지밖에 없습니다 — 구간화의 흔적이에요.

Python 브라우저에서 실행

# 품질 문자를 숫자로 되돌린다
qual = "FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFFFFFFFFFF#F"

qs = [ord(c) - 33 for c in qual]
print("품질줄:", qual)
print()
seen = sorted(set(qual))
print("%6s %6s %14s %12s" % ("문자", "Q", "오류 확률", "몇 번"))
for c in seen:
    q = ord(c) - 33
    print("%6s %6d %14.4f %11d번" % (c, q, 10 ** (-q / 10), qual.count(c)))
print()
print("서로 다른 품질값이 %d가지뿐입니다." % len(seen))
print("NovaSeq · NextSeq 1000/2000 은 Q점수를 네 칸으로 뭉개서 적습니다 (4강).")
print()
print("평균 Q: %.1f" % (sum(qs) / len(qs)))
print("Q30 이상인 글자: %.0f%%" % (sum(1 for q in qs if q >= 30) / len(qs) * 100))

R1 과 R2 의 관계

bulk RNA-seq

R1 · R2 둘 다 cDNA
같은 조각의 양쪽 끝
둘 다 유전체에 붙인다

10x 단일세포

R1 은 이름표(바코드+UMI)
R2 만 cDNA
R1 은 유전체에 안 붙인다

같은 기계, 같은 파일 형식인데 R1 의 뜻이 다릅니다. 라이브러리를 어떻게 만들었느냐가 정해요. 이것을 헷갈리면 정렬이 통째로 실패합니다.

고등학생파일 크기와 압축

상태	크기 (예)
압축 해제	수십 GB
gzip 압축	3~4분의 1

FASTQ는 압축한 채로 다룹니다 — 대부분의 도구가 .gz를 바로 읽어요.

양말단이면 R1과 R2 두 파일입니다. 순서가 맞아야 하니 따로 정렬하거나 걸러 내면 안 됩니다.

🤔 확인 문제

FASTQ 이름줄의 1101:24578:1000 은 무엇인가?

🤔 확인 문제

품질줄에 F 가 뜻하는 Q점수는? (Phred+33)

해설 F 의 아스키 값은 70 이고, 70 − 33 = 37 입니다. 오류 확률 약 2/10,000 으로 아주 좋은 글자예요.