Lesson 17 of 20

정규화 — CPM · TPM · FPKM, 그리고 DESeq2 가 쓰는 것

【실습】 세 가지를 손으로 계산해 비교한다

카운트 표의 숫자는 그대로 쓰면 안 됩니다. 두 가지가 섞여 있어요.

① 시료마다 총 읽기가 다르다

A 시료 3천만, B 시료 1천만
같은 유전자라도 A 가 세 배로 보인다

② 유전자마다 길이가 다르다

긴 유전자는 조각이 많이 나온다
같은 분자 수라도 읽기는 더 많다

①만 고치면 CPM, ①②를 다 고치면 TPM · FPKM 입니다.

High school무엇으로 나눌 것인가

보정할 것	왜
시퀀싱 깊이	많이 읽으면 모든 카운트가 큼
유전자 길이	긴 유전자에서 read가 더 많이 나옴
조성 편향	한 유전자가 압도하면 나머지가 눌림

셋을 다 보정하는 하나의 방법은 없습니다 — 목적에 맞춰 고릅니다.

세 가지 셈

	셈	고치는 것	쓸 곳
CPM	카운트 ÷ 총카운트 × 10⁶	깊이만	같은 유전자를 시료끼리 견줄 때
FPKM	먼저 깊이로 나누고, 그다음 길이로	깊이 + 길이	옛 논문에서 많이 본다
TPM	먼저 길이로 나누고, 그다음 합으로	깊이 + 길이	같은 시료 안에서 유전자끼리 견줄 때

TPM 과 FPKM 은 나누는 순서만 다릅니다. 그런데 그 순서가 중요한 성질 하나를 바꿔요 — TPM 은 시료마다 합이 정확히 100만 입니다.

High school세 가지 지표

지표	보정	쓰는 곳
CPM	깊이만	같은 유전자를 표본끼리
FPKM/RPKM	깊이 + 길이 (깊이 먼저)	관례 · 권장 안 함
TPM	깊이 + 길이 (길이 먼저)	한 표본 안에서 유전자끼리

TPM은 합이 항상 100만입니다 — FPKM은 표본마다 합이 달라 비교가 어렵습니다.

TPM 의 합이 늘 100만인 것이 이 방식의 핵심 성질입니다.

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# 세 가지를 손으로 계산한다
genes  = ["ACTB", "GAPDH", "CD3D", "LONG1", "SHORT1"]
length = [1852,   1310,    900,    22000,   410]        # bp
count  = [52000,  41000,   1200,   3800,    900]

total = sum(count)
print("총 카운트: %s" % format(total, ","))
print()

# CPM — 깊이만
cpm = [c / total * 1e6 for c in count]

# FPKM — 깊이 먼저, 길이 나중
fpkm = [c / (total / 1e6) / (l / 1000) for c, l in zip(count, length)]

# TPM — 길이 먼저, 합 나중
rate = [c / (l / 1000) for c, l in zip(count, length)]
rsum = sum(rate)
tpm = [r / rsum * 1e6 for r in rate]

print("%-8s %8s %9s %10s %10s %10s" % ("유전자", "길이", "카운트", "CPM", "FPKM", "TPM"))
for i, g in enumerate(genes):
    print("%-8s %8d %9d %10.0f %10.1f %10.0f"
          % (g, length[i], count[i], cpm[i], fpkm[i], tpm[i]))
print()
print("CPM 합계:  %10.0f" % sum(cpm))
print("FPKM 합계: %10.0f   <- 시료마다 다르다" % sum(fpkm))
print("TPM 합계:  %10.0f   <- 언제나 정확히 100만" % sum(tpm))

High school표본끼리 비교할 때는 길이 보정이 불필요

중요한 점입니다. 같은 유전자를 표본끼리 비교하면 길이가 같습니다.

비교	길이 보정
표본 A의 유전자 X vs 표본 B의 유전자 X	불필요
한 표본 안에서 유전자 X vs 유전자 Y	필요

차등발현 분석에는 길이 보정이 필요 없습니다 — 그래서 원시 카운트를 씁니다.

그런데 DESeq2 는 이 셋을 쓰지 않는다

차등발현을 볼 때는 CPM·TPM·FPKM 을 넣으면 안 됩니다. DESeq2 는 원래 카운트를 그대로 받습니다.

이유가 둘이에요.

	왜
1	통계 모형이 정수 카운트를 전제한다 (음이항 분포 — 18강)
2	총합으로 나누면 아주 센 유전자 하나가 나머지를 전부 끌어내린다

대신 중앙값비(median of ratios) 라는 다른 방법을 씁니다.

DESeq2 가 총합 대신 중앙값비를 쓰는 이유 — 딱 이 한 가지입니다.

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# 총합으로 나누면 왜 위험한가 — 그리고 중앙값비가 어떻게 고치나
import numpy as np

genes = ["G%d" % i for i in range(1, 9)]
# 두 시료는 사실 거의 같다. 딱 하나, HUGE 만 B 에서 폭발했다.
A = np.array([100, 200, 150, 300, 250, 180, 220,  1000])
B = np.array([100, 200, 150, 300, 250, 180, 220, 60000])

print("%-8s %9s %9s" % ("유전자", "A", "B"))
for g, a, b in zip(genes, A, B):
    print("%-8s %9d %9d" % (g, a, b))
print()

# 방법 1: 총합으로 나눈다 (CPM 식)
a_cpm = A / A.sum() * 1e6
b_cpm = B / B.sum() * 1e6
print("총합 정규화 뒤, G1 의 값:  A %8.0f   B %8.0f" % (a_cpm[0], b_cpm[0]))
print("   -> G1 은 변하지 않았는데 %.1f배 줄어든 것처럼 보입니다."
      % (a_cpm[0] / b_cpm[0]))
print()

# 방법 2: 중앙값비 (DESeq2 식)
ref = np.exp(np.mean(np.log(np.vstack([A, B])), axis=0))     # 기하평균 기준선
sf_a = np.median(A / ref)
sf_b = np.median(B / ref)
print("크기인자:  A %.3f   B %.3f" % (sf_a, sf_b))
print("중앙값비 뒤, G1 의 값:     A %8.1f   B %8.1f" % (A[0] / sf_a, B[0] / sf_b))
print("   -> 변하지 않은 것으로 제대로 나옵니다.")
print()
print("중앙값을 쓰기 때문에 유전자 하나가 폭발해도 흔들리지 않습니다.")

High schoolDESeq2가 쓰는 것

DESeq2는 CPM도 TPM도 안 씁니다. 크기인자를 씁니다.

단계	내용
1	유전자마다 모든 표본의 기하평균을 구함
2	각 표본에서 (카운트 ÷ 기하평균)을 계산
3	그 비율의 중앙값이 그 표본의 크기인자

중앙값을 쓰니 극단적인 유전자에 안 흔들립니다 — 총합으로 나누는 것과의 차이입니다.

한 유전자가 폭발적으로 발현되면 총합이 커집니다. CPM으로 나누면 나머지가 다 낮아 보여요. 크기인자는 그 문제를 피합니다.

🤔 Check yourself

TPM 의 합이 시료마다 정확히 100만인 이유는?

🤔 Check yourself

DESeq2 에 넣어야 하는 값은?