16강 / 20강

함정 — 앞에서 정한 것이 여기서 돌아온다

배치효과 · 3′ 치우침 · rRNA 잔량 · 다중 정렬

카운트 표가 나왔습니다. 이제 그 표를 믿어도 되는지를 봅니다.

가장 무서운 것은 오류가 나지 않는 문제들이에요. 프로그램은 조용히 끝나고, 표도 멀쩡해 보이고, 그림도 그려집니다. 그런데 결론이 틀립니다.

고등학생앞에서 정한 것이 여기서 돌아온다

함정	어디서 생겼나
배치효과	시료 처리 시기 · 실행 (2·8강)
3′ 치우침	RNA 분해 (8·9강)
rRNA 잔량	제거 방법 (10강)
다중 정렬	read 길이 (2·15강)

넷 다 분석 단계의 문제가 아닙니다 — 앞에서 정해진 것입니다.

배치효과 — 가장 흔하고 가장 큰 것

같은 시료라도 다른 날, 다른 키트, 다른 플로우셀로 만들면 발현량이 조금씩 달라집니다. 그 차이가 진짜 생물학적 차이보다 클 때가 많아요.

망한 설계

1차 런: 대조군 6개
2차 런: 처리군 6개
→ 배치와 조건이 완전히 겹친다
→ 통계로 영영 못 가른다

옳은 설계

1차 런: 대조군 3 + 처리군 3
2차 런: 대조군 3 + 처리군 3
→ 배치를 모형에 넣어 뺄 수 있다
→ ~ batch + condition

고등학생배치효과

같은 시료라도 언제·어디서 처리했느냐에 따라 결과가 달라집니다.

배치를 만드는 것	내용
추출 날짜	시약 로트 · 사람
라이브러리 제작 일자	—
시퀀싱 실행	플로우셀 · 레인

해법은 설계입니다 — 각 배치에 모든 군을 고루 넣으세요.

대조군을 1차 배치에, 처리군을 2차 배치에 넣으면 배치와 처리가 겹칩니다. 그러면 보정으로도 못 고칩니다.

같은 자료, 같은 통계, 다른 배정 — 결론이 뒤집힙니다.

Python 브라우저에서 실행

# 배치와 조건이 겹치면 무슨 일이 생기나
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(13)

n = 6
true_effect = 0.0          # 처리 효과는 실제로 0 이다
batch_shift = 2.5          # 배치 사이의 차이

# 망한 설계: 대조군은 전부 배치1, 처리군은 전부 배치2
ctrl_bad = rng.normal(10.0, 0.4, n)
trt_bad  = rng.normal(10.0 + true_effect + batch_shift, 0.4, n)

# 옳은 설계: 배치마다 절반씩
ctrl_ok = np.concatenate([rng.normal(10.0, 0.4, n // 2),
                          rng.normal(10.0 + batch_shift, 0.4, n // 2)])
trt_ok  = np.concatenate([rng.normal(10.0 + true_effect, 0.4, n // 2),
                          rng.normal(10.0 + true_effect + batch_shift, 0.4, n // 2)])

print("진짜 처리 효과: %.1f  (없다)" % true_effect)
print()
print("망한 설계 — 관측된 차이: %+.2f" % (trt_bad.mean() - ctrl_bad.mean()))
print("   -> 처리 효과라고 발표하게 됩니다. 실제로는 배치 차이입니다.")
print()
print("옳은 설계 — 관측된 차이: %+.2f" % (trt_ok.mean() - ctrl_ok.mean()))
print("   -> 배치를 모형에 넣으면 차이가 사라집니다.")

고등학생3′ 치우침

RNA가 분해되면 조각이 짧아집니다. 그런데 polyA 선택을 쓰면 3′ 끝만 남아요.

RNA 상태	read 분포
온전함 (RIN 9)	전사체 전체에 고르게
분해됨 (RIN 5)	3′ 쪽에 몰림

긴 유전자일수록 손해입니다 — 3′ 조각만 남으면 정량이 낮게 나옵니다.

시료마다 RIN이 다르면 그 자체가 배치효과가 됩니다. 그래서 9강의 RIN을 기록하고 비슷하게 맞춰야 해요.

앞 강의에서 온 나머지 함정 넷

보이는 증상	원인	어디서 정해졌나	고칠 수 있나
엑손 비율이 낮다	gDNA 오염	8강 — DNase 를 빠뜨렸다	부분적으로
읽기가 유전자 3′ 끝에 몰린다	3′ 치우침	9강 — RIN 이 낮았다	못 고친다
mRNA 읽기가 적다	rRNA 잔량	10강 — 제거가 덜 됐다	깊이를 더 주면
없는 유전자가 조금씩 보인다	인덱스 호핑	11강 — 조합형 인덱스	못 고친다
유사유전자 카운트가 이상하다	다중 정렬	15강 — 반복서열	도구가 나눠 준다

9강의 RIN 이 17강의 정규화를 무너뜨리는 길.

Python 브라우저에서 실행

# 3' 치우침을 숫자로 본다
import numpy as np

L = 100                      # 유전자를 100칸으로 나눈다
pos = np.arange(L)

# RIN 이 높으면 고르게, 낮으면 3' 끝에 몰린다
good = np.ones(L)
bad  = np.exp(pos / 22.0)    # 3' 쪽(뒤)으로 갈수록 급히 는다

for name, cov in [("RIN 9", good), ("RIN 4", bad)]:
    cov = cov / cov.sum()
    first = cov[:20].sum() * 100        # 5' 쪽 20%
    last  = cov[-20:].sum() * 100       # 3' 쪽 20%
    print("%-8s  5' 쪽 20%%: %5.1f%%   3' 쪽 20%%: %5.1f%%   비율 %.1f배"
          % (name, first, last, last / first))
print()
print("RIN 이 낮으면 읽기가 3' 끝에 몰립니다.")
print("긴 유전자일수록 더 많이 잃습니다 — 길이 보정(TPM)이 오히려 틀어집니다.")

고등학생rRNA 잔량과 다중 정렬

rRNA 잔량이 높으면	내용
유효 read가 줄어듦	같은 비용에 정보가 적음
시료마다 다르면	깊이가 불균일 — 배치효과

다중 정렬이 많으면	내용
패밀리 유전자	어느 것인지 불명
가유전자	진짜 유전자와 헷갈림
반복 서열	—

"이 유전자는 발현이 없다"가 정렬이 안 된 것일 수 있습니다.

🤔 확인 문제

배치와 조건이 완전히 겹친 실험은 어떻게 고치나?

🤔 확인 문제

RIN 이 낮은 시료에서 읽기가 3′ 끝에 몰리면 무엇이 뒤틀리나?