2. 물 — 가장 많이 넣고 가장 만만하게 보는 시약 · Dr. Yoo's mRNA Synthesis Reagents, First Steps

논문은 방법 문단 끝에 이렇게 적었습니다.

DEPC-treated water (0.1%) was used in all solution preparations unless
specifically mentioned. All centrifuge tubes were autoclaved, and all surfaces were
treated with RNase Zap and 0.1% DEPC-treated water to eliminate any possible RNase
contamination.

시약 이름이 아니라 규율이 적혀 있습니다. 물 · 튜브 · 표면, 세 가지를 각각 다르게 다뤘습니다. 왜 세 가지인지를 알면 이 문단이 짧은 이유도 압니다.

무엇을	어떻게	없애려는 것
물과 용액	DEPC 처리 0.1%	물에 녹아 있는 RNase
원심분리 튜브	오토클레이브 (121 °C 고압증기)	세균과 그 효소
표면 · 손이 닿는 곳	RNase Zap 뒤 DEPC 처리수	사람에게서 온 RNase

“오토클레이브만 하면 되지 않나”

안 됩니다. 이것이 mRNA 실험의 첫 함정입니다.

오토클레이브가 잘하는 것

살아 있는 것을 죽입니다. 세균 · 곰팡이 · 포자. DNA 실험에서는 이걸로 충분합니다.

오토클레이브가 못 하는 것

RNase A 는 삶아도 다시 접힙니다. 121 °C 에서 풀렸다가 식으면서 제 모양을 되찾습니다. 세균을 죽여도 효소는 남습니다.

그래서 순서가 둘입니다. 튜브는 오토클레이브로 살균하고, 물과 표면은 화학적으로 RNase 를 부숩니다. 논문이 세 문장을 나눠 쓴 이유입니다.

반응통 200 µL 에서 물이 차지하는 부피를 봅니다. 그리고 그 물에 RNase 가 조금 있을 때 무슨 일이 생기는지 밀어 보세요.

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물이 전체의 절반을 넘습니다. 가장 많이 넣는 것을 가장 만만하게 보는 것이 사고의 출발점입니다.

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# 200 µL 반응통에서 물은 얼마인가 — IVT 조성을 그대로 채워 본다 (Wei 2023, IVT 단락)
V = 200.0                  # µL, 전체
t7_mix   = 20.0            # µL, T7 중합효소 혼합
buf5x    = V / 5           # 5x 완충액은 1/5 부피
# 뉴클레오타이드와 캡은 저장액 농도가 논문에 없다 — 100 mM 저장액이라고 가정한다
stock_mM = 100.0
need = {"rATP": 1.875, "rCTP": 1.875, "rUTP": 1.875, "rGTP": 0.225, "캡 유사체": 0.375}
vol = {k: c / stock_mM * V for k, c in need.items()}

used = t7_mix + buf5x + sum(vol.values())
water = V - used

print("전체 %.0f µL" % V)
print("  T7 혼합        %6.1f µL" % t7_mix)
print("  5x 완충액      %6.1f µL" % buf5x)
for k, v in vol.items():
    print("  %-12s %6.2f µL  (%.3f mM)" % (k, v, need[k]))
print("  ────────────────────────")
print("  물             %6.1f µL   ← 전체의 %.0f%%" % (water, water / V * 100))
print()
print("가정: 뉴클레오타이드·캡 저장액을 100 mM 로 잡았다. 논문에 저장액 농도는 없다.")
print("저장액이 진하면 물이 더 늘고, 묽으면 물이 준다 — 어느 쪽이든 물이 가장 많다.")

“nuclease-free” 와 “DEPC 처리” 는 같은 말이 아니다

표기	뜻	보증하는 것
nuclease-free	제조사가 검정해서 판다	시험으로 확인한 수준 아래 — 시험 감도만큼만
DEPC-treated	DEPC 를 넣어 처리했다	처리했다는 사실. 남은 RNase 양은 모른다
autoclaved	고압증기로 살균했다	살아 있는 것이 없다. 효소는 남을 수 있다

세 표기가 각각 다른 것을 보증합니다. 논문은 셋을 겹쳐 썼습니다 — 어느 하나도 혼자서는 충분하지 않기 때문입니다.

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