3. RNase 억제제 0.5 U/µL — 적을 막는 시약 · Dr. Yoo's mRNA Synthesis Reagents, First Steps

앞 강의 끝에서 물을 다뤘습니다. 그런데 논문은 정제 단계에서 한 걸음 더 나갑니다 — 완충액 안에 억제제를 함께 넣었습니다.

완충액	조성	억제제
결합 완충액 100 µL	Tris-HCl 40 mM (pH 7.5) · LiCl 1.6 M · EDTA	0.5 U/µL
세척 완충액 200 µL × 2	Tris-HCl 10 mM (pH 7.5) · LiCl 0.15 M · EDTA 1 mM	0.5 U/µL

왜 하필 여기일까요. 답은 그때 mRNA 가 가장 벗겨져 있기 때문입니다.

“U” 는 무게가 아니다

RNase 억제제는 0.5 U/µL 로 적혀 있습니다. mg 이나 mM 이 아니라 U 입니다. U(unit)는 일하는 속도로 매긴 단위입니다 — 정해진 조건에서 정해진 양을 처리하는 능력.

U 는 “얼마나 들었나” 가 아니라 “얼마나 해낼 수 있나” 다

그래서 U 는 제조사와 조건에 묶여 있습니다. 같은 1 U 라도 회사마다 재는 방법이 다를 수 있습니다. 이 강의에 나오는 효소는 전부 U 로 적혀 있습니다 — LA Taq 10 U, DNase 10 U, E-PAP 40 U, 그리고 여기 억제제 0.5 U/µL.

RNase 가 얼마나 무서운지 재 봅니다. 오염된 양과 시간을 밀면 남는 mRNA 가 달라집니다.

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왜 “조금 들어가도 괜찮다” 가 성립하지 않는지 자리수로 봅니다. 이것이 규모 감각입니다.

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# RNase A 한 마리가 얼마나 빠른지 — 규모를 먼저 잡는다.
# 가정: RNase A 의 회전수를 1초에 약 1000 회 자르기로 잡는다(통상 보고 범위의 어림값).
# 논문에는 이 값이 없다. 크기 감각을 얻기 위한 계산이다.
NA = 6.022e23
mw_rnaseA = 13700.0        # g/mol
kcat = 1000.0              # 1/s, 가정

for pg in (1.0, 10.0, 100.0):
    mol = pg * 1e-12 / mw_rnaseA
    n = mol * NA
    cuts_per_min = n * kcat * 60
    print("RNase A %6.1f pg → 분자 %9.2e 개 → 1분에 최대 %9.2e 번 자른다"
          % (pg, n, cuts_per_min))

print()
# 우리 쪽 mRNA 분자 수는 얼마인가 — 300 µg, 1500 nt 로 잡는다 (Fig. 4e 규모)
ug, nt = 300.0, 1500.0
mrna_mol = (ug * 1e-6) / (nt * 330.0)
print("mRNA 300 µg (1500 nt) = %.2e 분자" % (mrna_mol * NA))
print()
print("1 pg 의 RNase 가 1분에 낼 수 있는 절단 횟수가 이미 우리 분자 수와 같은 자리수다.")
print("한 번만 잘려도 그 mRNA 는 단백질을 끝까지 만들지 못한다.")

억제제는 무엇을 하나

🛡️

단백질 억제제

RNase 에 꽉 달라붙어 일을 못 하게 합니다. 흔히 쓰는 것이 사람·돼지 유래 RNase 억제제 단백질입니다

🧊

약점

자기도 단백질입니다. 열·산화·환원제 없는 조건에서 힘을 잃습니다 — 65 °C 단계에서 믿을 수 없습니다

🚫

DEPC 와 다르다

DEPC 는 부수고 사라집니다. 억제제는 붙어 있습니다 — 즉 반응통에 계속 남습니다

그래서 논문의 배치가 합리적입니다. 물과 표면은 DEPC 로 미리 처리하고, 정제 완충액에는 억제제를 함께 넣습니다. 하나는 예방, 하나는 보험입니다.

🤔 Check yourself

RNase 억제제를 IVT 반응통이 아니라 정제 완충액에 넣은 배치를 어떻게 읽는 것이 가장 알맞은가?

🤔 Check yourself

“0.5 U/µL” 이라는 표기에서 U 가 뜻하는 것은?