16. oligo d(T)₂₅ 비드 — 꼬리를 낚는 시약, 그리고 “3.2 µL 의 2.0 mM” · Dr. Yoo's mRNA Synthesis Reagents, First Steps

정제 걸음입니다. 15강에서 붙인 A 꼬리가 여기서 손잡이가 됩니다. 비드 표면에 T 가 스물다섯 개 이어진 짧은 DNA 가 붙어 있고, 그것이 A 꼬리와 염기쌍을 이룹니다.

꼬리를 붙인 이유의 절반은 안정성이고, 절반은 이 정제다

논문의 처방을 그대로 펴 봅니다.

단계	완충액	조건
비드 준비	결합 완충액 100 µL 로 비드 200 µL 를 한 번 씻고 다시 띄운다	—
mRNA 풀기	—	65 °C 5분
결합	(위 결합 완충액)	실온 5분
세척	세척 완충액 200 µL	2회
용출	nuclease-free water 200 µL	—

결합 온도와 세척 횟수를 밀어 보세요. 회수율과 순도가 어떻게 맞바뀌는지 보여 줍니다.

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방법 문단에서 잘 생기는 일 — 농도가 아니라 부피로 적힌 성분

결합 완충액의 조성을 논문은 이렇게 적었습니다.

100 μL of binding buffer containing 40.0 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.6 M LiCl,
3.2 μL of 2.0 mM EDTA, and 0.5 U/μL RNase inhibitor

셋은 농도인데 EDTA 만 “3.2 µL 의 2.0 mM” 로 적혀 있습니다. 부피와 저장액 농도를 준 것이니, 우리가 최종 농도로 되돌려야 합니다.

부피로 적힌 성분을 최종 농도로 되돌리는 연습입니다. 되돌려 놓으면 다른 완충액과 견줄 수 있습니다.

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# '3.2 µL 의 2.0 mM EDTA' 를 최종 농도로 되돌린다
V_buffer_uL = 100.0
add_uL, stock_mM = 3.2, 2.0

nmol = stock_mM * 1e-3 * add_uL * 1e-6 * 1e9      # nmol
final_uM = nmol / (V_buffer_uL * 1e-6) / 1e9 * 1e6

print("넣은 EDTA: %.4f nmol" % nmol)
print("최종 농도: %.1f µM  (= %.4f mM)" % (final_uM, final_uM / 1000))
print()
print("견주기")
print("  포획 완충액의 EDTA   1000.0 µM")
print("  세척 완충액의 EDTA   1000.0 µM")
print("  결합 완충액의 EDTA  %7.1f µM  ← 훨씬 묽다" % final_uM)
print()
print("왜 여기만 묽은가? 이 완충액에는 RNase 억제제(단백질)가 함께 들어 있고,")
print("바로 앞 걸음에서 Mn2+ 를 쓴 반응액이 따라올 수 있다.")
print("EDTA 를 세게 넣으면 금속을 몰아내는 대신 억제제·효소 쪽 사정이 복잡해진다.")
print()
print("주의: 위 해석은 우리의 추론이다. 논문은 이유를 적지 않았다.")

이 정제가 못 하는 일

걸러 주는 것

· 꼬리 없는 것 — 끝까지 전사되지 않은 짧은 조각
· 뉴클레오타이드 · 소금 · 대부분의 단백질
· 꼬리 없는 주형 조각

그냥 통과하는 것

· 꼬리가 붙은 채 중간이 끊긴 mRNA
· 꼬리가 붙은 dsRNA
· 5′ 캡이 없거나 거꾸로 달린 전사체 — 꼬리만 보므로

즉 이 정제는 3′ 끝만 봅니다. 캡은 5′ 끝에 있고, 온전성은 중간에 있습니다. 그래서 II권(/msyn2)이 다중모드 크로마토그래피로 갈아탑니다 — “꼬리만 보는 정제” 를 넘어서려는 것입니다.

🤔 Check yourself

65 °C 5분 뒤 곧바로 비드와 섞으라고 적은 까닭은?

🤔 Check yourself

oligo d(T)₂₅ 정제를 통과해 버리는 것은?