15. E-PAP 40 U 과 MnCl₂ 2.5 mM — 금속을 바꿔 넣는 효소

이름부터 풉니다. E-PAP = E. coli Poly(A) Polymerase. 대장균의 poly(A) 중합효소입니다. 하는 일은 하나 — RNA 의 3′ 끝에 A 를 계속 붙이는 것입니다.

논문의 조성을 그대로 옮깁니다.

시약	얼마	노릇
E-PAP	40 U	A 를 붙인다
5× E-PAP 완충액	1배로	pH · 소금 · 안정화제
MnCl₂	2.5 mM	이 효소의 금속 조효소
ATP	1 mM	꼬리의 재료 — A 하나가 ATP 하나
전체	400 µL · 37 °C · 1시간	부피가 두 배가 된다

ATP 농도와 꼬리 길이를 밀어 보세요. 재료가 꼬리 길이를 어디서 막는지 보여 줍니다.

불러오는 중…

ATP 가 천장인지 아닌지 계산합니다. 아니라면 꼬리 길이는 무엇이 정하는지 물어야 합니다.

Python 브라우저에서 실행

# ATP 1 mM 은 '150 염기 이상' 짜리 꼬리를 몇 분자에 붙일 수 있나
V_L = 400e-6
atp_nmol = 1e-3 * V_L * 1e9
print("반응통의 ATP: %.0f nmol" % atp_nmol)
print()

# 꼬리를 붙일 mRNA 분자 수 — 수율 300 µg, 길이 1500 nt 로 잡는다 (Fig. 4e 규모)
ug, nt = 300.0, 1500.0
mrna_nmol = ug * 1e-6 / (nt * 330.0) * 1e9
print("mRNA 300 µg (1500 nt) = %.3f nmol" % mrna_nmol)
print()
for tail in (100, 150, 300, 600):
    need = mrna_nmol * tail
    print("  꼬리 %3d 염기 → ATP %7.1f nmol 필요  (있는 양의 %5.1f%%)"
          % (tail, need, need / atp_nmol * 100))
print()
print("논문은 '150 염기 이상' 이라고 적었다. 그 조건에서 ATP 는 %.1f 배 남는다."
      % (atp_nmol / (mrna_nmol * 150)))
print("즉 꼬리 길이를 정하는 것은 재료가 아니라 '시간과 효소' 다 — 37 °C 1시간.")

EDTA 와 Mn²⁺ 의 다툼

4강에서 EDTA 를 배웠습니다. 여기서 부딪칩니다 — EDTA 는 Mn²⁺ 도 붙잡습니다. 그리고 앞 걸음(10강의 DNA 포획)의 완충액에 EDTA 1 mM 이 있었습니다.

시약 하나가 앞 단계에서 따라오는 경우를 계산합니다. 이것이 공정을 읽는 눈입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 앞 단계 완충액이 조금 따라오면 Mn2+ 는 얼마나 줄어드나 (1:1 킬레이트로 계산)
V_rxn = 400.0          # µL
mn_mM = 2.5
mn_nmol = mn_mM * 1e-3 * V_rxn * 1e-6 * 1e9

print("반응통의 Mn2+: %.0f nmol (%.1f mM)" % (mn_nmol, mn_mM))
print()
print("포획 완충액(EDTA 1.0 mM)이 부피의 몇 %% 만큼 따라왔다고 하면:")
for pct in (0, 1, 5, 10, 25):
    carry_uL = V_rxn * pct / 100.0
    edta_nmol = 1.0 * 1e-3 * carry_uL * 1e-6 * 1e9
    left = mn_nmol - edta_nmol
    print("  %3d%% 따라옴 → EDTA %6.2f nmol → 남는 Mn2+ %6.2f nmol (%.2f mM)"
          % (pct, edta_nmol, left, left / (V_rxn * 1e-6 * 1e9) * 1e3))
print()
print("EDTA 1 mM 은 Mn 2.5 mM 보다 묽어서, 전부 따라와도 Mn 을 다 없애지는 못한다.")
print("이 배치는 우연이 아니라 여유(2.5배)를 둔 것으로 읽는 편이 맞다.")
print()
print("가정: 킬레이트가 1:1 이고 다른 금속과 경쟁하지 않는다고 보았다.")

🤔 확인 문제

E-PAP 만 Mg²⁺ 대신 Mn²⁺ 를 쓰는 까닭으로 가장 알맞은 것은?

🤔 확인 문제

꼬리가 “150 염기 이상” 붙는 것을 정하는 것은 무엇인가? (위 계산에 따르면)