Lesson 4 of 20

miRNA 발현은 심하게 기울어져 있다

두 종류가 전체의 35% · 절반은 아예 0 · 이것이 분석에 미치는 영향

mRNA 자료에 익숙한 사람이 miRNA 자료를 처음 보면 놀라는 것이 있습니다. 발현이 지나치게 한쪽으로 쏠려 있다는 점입니다.

얼마나 쏠렸는지 직접 세어 봅시다.

High school두 종류가 전체의 35%

miRNA 발현 분포는 극단적으로 기울어져 있다.

관찰	값
상위 2종이 차지하는 비율	약 35%
발현이 0 인 miRNA	약 절반

이것이 정상인가

정상이다. 대부분의 조직에서 그렇다. 소수의 miRNA 가 대부분의 분자를 차지하고, 나머지는 아주 적거나 없다.

세포마다 필요한 miRNA 가 정해져 있고, 필요 없는 것은 아예 안 만들기 때문이다.

기울어진 분포는 자료의 결함이 아니라 생물학적 사실이다

전체를 100만으로 놓았으니 CPM 을 1만으로 나누면 곧 백분율입니다.

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import pandas as pd

mi = pd.read_csv("mirna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MIWT = ["WT_Ddx54_1", "WT_Ddx54_2", "WT_Ddx54_3"]
cpm = mi / mi.sum(axis=0) * 1e6

wt = cpm[MIWT].mean(axis=1).sort_values(ascending=False)

print(f"표에 실린 miRNA        : {len(mi):>6,} 종")
print(f"어느 표본에서도 0 인 것 : {(mi.sum(axis=1) == 0).sum():>6,} 종")
print(f"WT 에서 CPM ≥ 10 인 것  : {(wt >= 10).sum():>6,} 종")
print()
print("── WT 에서 가장 많은 10종 ──")
for name, v in wt.head(10).items():
    print(f"  {name:<20}{v:>10,.0f} CPM   {v / 1e4:>5.2f}%")

High school0 이 절반이라는 것의 의미

0 인 이유	내용
정말 없다	그 조직에서 안 만듦
너무 적어서 못 잡음	검출 한계 아래
주석 오류	실제로 존재하지 않는 miRNA

세 번째가 의외로 많다

miRBase 에 등록된 miRNA 중 상당수가 실재가 의심스럽다 는 지적이 오래전부터 있었다. 시퀀싱 잡음을 miRNA 로 잘못 등록한 경우가 있다.

1,976 종 중 절반이 0 이라는 것은 그중 상당수가 이 조직에 없거나 애초에 존재하지 않을 수 있다는 뜻이다.

그래서 필터링을 한다

"최소 몇 표본에서 최소 몇 CPM 이상" 같은 기준으로 걸러낸다. 그러면 검정 횟수가 줄어들어 다중검정 부담도 준다(8강).

발현이 없는 것을 미리 걸러내는 것은 검정력을 높이는 가장 값싼 방법이다

누적 비율. 상위 100종에서 이미 97% 입니다 — 나머지 1,876종이 3% 를 나눠 갖습니다.

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import pandas as pd, numpy as np

mi = pd.read_csv("mirna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MIWT = ["WT_Ddx54_1", "WT_Ddx54_2", "WT_Ddx54_3"]
MIKD = ["Ddx54_KD_1", "Ddx54_KD_2", "Ddx54_KD_3"]
cpm = mi / mi.sum(axis=0) * 1e6

wt = cpm[MIWT].mean(axis=1).sort_values(ascending=False)

tot = wt.sum()
print("상위 k 종이 차지하는 비율")
for k in [1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500]:
    share = wt.head(k).sum() / tot * 100
    print(f"  상위 {k:>4} : {share:>6.2f} %   {'▇' * int(share / 2)}")

이 치우침이 왜 문제인가

① 정규화가 흔들린다

let-7j 하나가 20% 를 차지합니다. 이 하나가 30% 로 늘면 나머지 전부의 CPM 이 12% 씩 저절로 줄어듭니다.

3강의 구성적 편향이 여기서 현실이 된다

② 검정력이 극단적으로 다르다

CPM 4,000 인 miRNA 는 1.2 배 변화도 잡아내지만, CPM 2 인 miRNA 는 10 배가 변해도 잡히지 않습니다.

같은 표에 실렸다고 같은 잣대가 아니다

그래서 miRNA 차등발현을 볼 때는 발현량 문턱을 반드시 겁니다. 이 강의에서는 평균 CPM ≥ 10 을 씁니다. 문턱을 어디에 두느냐로 결론이 얼마나 바뀌는지는 위젯에서 직접 옮겨 보세요.

High school기울어진 분포가 검정에 미치는 영향

문제	내용
정규성 가정 위배	t검정의 전제가 안 맞음
분산이 평균에 의존	발현이 낮을수록 상대 분산이 큼
지배종이 정규화를 흔듦	3강
낮은 발현의 배수변화가 과장됨	1 → 3 이면 3배

마지막 줄이 흔한 함정이다

read 가 1개에서 3개로 늘면 3배 다. 그런데 그것은 우연으로 충분히 생긴다.

1,000개에서 3,000개로 늘면 같은 3배지만 의미가 다르다.

그래서 로그를 취하고 낮은 발현을 거른다

로그 변환으로 분포를 대칭에 가깝게 만들고, 발현이 너무 낮은 것은 아예 제외한다.

같은 배수변화라도 발현 수준에 따라 신뢰도가 다르다

잡음의 크기가 발현량에 따라 달라진다는 것을 자료에서 직접 확인합니다.

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# 발현량에 따라 '검정이 얼마나 쉬운가' 가 어떻게 달라지는지 봅니다.
import pandas as pd, numpy as np

mi = pd.read_csv("mirna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MIWT = ["WT_Ddx54_1", "WT_Ddx54_2", "WT_Ddx54_3"]
MIKD = ["Ddx54_KD_1", "Ddx54_KD_2", "Ddx54_KD_3"]
cpm = mi / mi.sum(axis=0) * 1e6

lg = np.log2(cpm + 1)
sd = lg[MIWT].std(axis=1, ddof=1)          # WT 세 표본 사이의 흔들림
base = cpm[MIWT].mean(axis=1)

print("WT 발현량 구간별 · 표본 사이 표준편차(log2)")
for lo, hi in [(0.1, 1), (1, 10), (10, 100), (100, 1000), (1000, 1e9)]:
    sel = (base >= lo) & (base < hi)
    if sel.sum() < 5:
        continue
    print(f"  CPM {lo:>7.0f}~{hi if hi < 1e8 else float('inf'):>7.0f} : "
          f"{sel.sum():>5}종   중앙값 SD {sd[sel].median():.3f}")
print()
print("발현이 낮을수록 표본끼리 더 흔들립니다 — 잡아내기 어렵다는 뜻입니다.")

🎮 치우침 실험실

발현량 문턱을 옮기면서, 남는 miRNA 수와 잡음의 크기가 어떻게 변하는지 보세요.

High school그럼 어떻게 분석해야 하나

선택	이유
낮은 발현 필터링	잡음 제거 · 검정 수 감소
로그 변환	분포 대칭화
강건한 정규화 (TMM 등)	지배종의 영향 완화
음이항 모형 (DESeq2/edgeR)	계수 자료에 맞는 모형

이 강의는 단순한 t검정을 쓴다

브라우저에서 돌려야 하고, 절차를 손으로 따라가는 것이 목적이니까.

그런데 그 선택의 한계를 알고 쓴다. 18강에서 다른 방법으로 바꿔 보고 결론이 바뀌는지 확인한다.

단순한 방법을 쓰되 그 한계를 알고, 나중에 확인한다

🤔 Check yourself

이 자료에서 상위 10종의 miRNA 가 전체 발현량에서 차지하는 비율은?

🤔 Check yourself

1,976 종 가운데 927 종이 여섯 표본 전부에서 0 이라는 사실이 뜻하는 것은?

🤔 Check yourself

발현이 낮은 miRNA 에서 표본 사이 표준편차가 큰 것이 분석에 주는 함의는?