Lesson 6 of 20

차등발현 ② — mRNA 층, 그리고 녹다운 검증

Ddx54 는 정말 꺼졌나 · 24,419 개를 같은 방법으로 검정한다

miRNA 층에서 무엇이 변했는지 봤으니, 이제 mRNA 층입니다. 계산 방법은 토씨 하나 다르지 않습니다 — 표만 바뀝니다.

그런데 그 전에 반드시 해야 할 확인이 있습니다.

Ddx54 는 정말 꺼졌는가?

이 실험은 shRNA 로 Ddx54 를 녹다운(knockdown) 한 세포와 대조군을 비교한 것입니다. 녹다운이 실패했다면 두 무리는 그냥 같은 세포이고, 이후의 모든 분석은 잡음입니다. 가장 먼저 확인해야 할 한 줄입니다.

High school같은 방법을 24,419 개에

miRNA 층에서 한 것과 똑같은 절차 를 mRNA 층에도 적용한다.

	miRNA	mRNA
검정 수	약 347 (필터 후)	수천~수만
다중검정 부담	중간	큼
발현 분포	극단적으로 기울어짐	덜 기울어짐

검정 수가 많아지면

2만 개를 검정하면 아무 관계 없어도 p < 0.05 가 1,000개 나온다.

8강에서 이 문제를 정면으로 다룬다. 지금은 같은 절차를 쓰되 검정 수가 다르다 는 것만 기억하자.

같은 방법도 적용 횟수가 달라지면 결과의 뜻이 달라진다

결과를 보기 전에 실험이 되었는지부터 봅니다.

Python Runs in your browser

import pandas as pd, numpy as np
from scipy import stats

mr = pd.read_csv("mrna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MRWT = ["WT_DDX54_1", "WT_DDX54_2", "WT_DDX54_3", "WT_DDX54_4"]
MRKD = ["KD_DDX54_1", "KD_DDX54_2", "KD_DDX54_3"]

cpm = mr / mr.sum(axis=0) * 1e6

print("Ddx54 의 CPM")
print(f"  WT : {np.round(cpm.loc['Ddx54', MRWT].values, 1)}")
print(f"  KD : {np.round(cpm.loc['Ddx54', MRKD].values, 1)}")
print()
r = cpm.loc["Ddx54", MRKD].mean() / cpm.loc["Ddx54", MRWT].mean()
print(f"  KD / WT = {r:.2f}  →  약 {(1 - r) * 100:.0f}% 감소")
print()
print("  네 표본과 세 표본이 겹치지 않고 갈라집니다. 녹다운은 성공했습니다.")

High school녹다운 검증 — Ddx54 는 정말 꺼졌나

이 실험은 Ddx54 유전자를 녹다운 한 실험이다. 그러면 가장 먼저 확인할 것은 하나다.

Ddx54 발현이 실제로 내려갔나?

이것을 안 확인하면

가능성	결과
녹다운이 실패했다	모든 후속 분석이 무의미
부분적으로만 됐다	효과가 작게 나옴
잘 됐다	안심하고 진행

실험이 의도한 대로 되었는지 확인하는 것이 분석의 첫 단계여야 한다.

양성 대조를 먼저 확인하지 않고 시작한 분석은 바닥이 없다

발현 문턱을 CPM ≥ 1 로 두면 24,419개가 10,978개로 줄어듭니다.

Python Runs in your browser

# mRNA 층 전체를 5강과 똑같은 방법으로 검정합니다.
import pandas as pd, numpy as np
from scipy import stats

mr = pd.read_csv("mrna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MRWT = ["WT_DDX54_1", "WT_DDX54_2", "WT_DDX54_3", "WT_DDX54_4"]
MRKD = ["KD_DDX54_1", "KD_DDX54_2", "KD_DDX54_3"]
cpm = mr / mr.sum(axis=0) * 1e6

lg = np.log2(cpm + 1)
t, p = stats.ttest_ind(lg[MRKD], lg[MRWT], axis=1)
de = pd.DataFrame({"logFC": lg[MRKD].mean(axis=1) - lg[MRWT].mean(axis=1),
                   "p": p, "baseCPM": cpm.mean(axis=1)})
de = de[de.baseCPM >= 1]

print(f"검정 대상 유전자 : {len(de):,} 개 (전체 {len(mr):,} 중 CPM ≥ 1)")
print()
print("── KD 에서 가장 많이 내려간 8개 ──")
print(de.sort_values("logFC").head(8).round(4))
print()
print("── KD 에서 가장 많이 올라간 8개 ──")
print(de.sort_values("logFC", ascending=False).head(8).round(4))

표본 수가 다르다는 것

miRNA 는 3 대 3, mRNA 는 4 대 3 입니다. 이 차이가 결과에 영향을 줍니다.

자유도 — miRNA 는 4, mRNA 는 5. mRNA 쪽 t검정이 조금 더 유리합니다.
최소 p값 — 표본이 적으면 아무리 확실해도 p값이 어떤 값 아래로 내려가지 못합니다. 3 대 3 에서 t검정의 이론적 하한은 대략 10⁻⁴ 언저리입니다.

그래서 "miRNA 쪽 p값이 mRNA 쪽보다 크다" 는 사실만으로 miRNA 변화가 덜 확실하다고 말하면 안 됩니다. 자유도가 다를 뿐입니다.

High school녹다운의 정도를 어떻게 읽나

감소율	평가
90% 이상	훌륭함
70~90%	일반적 · 충분
50% 미만	약함 — 효과가 작을 수 있음
변화 없음	실패

그리고 RNA 와 단백질이 다르다

RNA 가 70% 줄어도 단백질은 덜 줄어들 수 있다. 단백질의 반감기가 길면 특히 그렇다.

반대로 RNA 가 조금만 줄어도 단백질이 크게 줄 수도 있다.

진짜 확인은 웨스턴 블롯 으로 해야 한다. RNA-seq 은 녹다운이 시도되었다 는 것까지만 말해 준다.

RNA 감소는 녹다운의 증거이지 단백질이 없다는 증거는 아니다

🎮 mRNA 화산도

같은 그림, 다른 층. 관심 유전자를 검색해 어디 있는지 찾아보세요.

High school두 층을 잇기 위한 준비

5강과 6강에서 각 층의 변화를 따로 봤다. 이제 이을 준비 가 되었다.

가진 것	내용
변화한 miRNA 목록	5강
변화한 mRNA 목록	6강
필요한 것	어느 mRNA 가 어느 miRNA 의 표적인가

세 번째가 9~13강의 주제다

표적 관계를 알아야 두 목록을 이을 수 있다. 그리고 그 표적 관계는 실험으로 확인된 것이 아니라 예측 이다.

예측을 어떻게 만드는지, 그 예측이 얼마나 믿을 만한지를 9~13강에서 다룬다.

두 층을 잇는 다리는 예측이다 — 그 다리의 튼튼함이 결론의 강도를 정한다

🤔 Check yourself

차등발현 분석에서 가장 먼저 확인해야 하는 것은?

🤔 Check yourself

shRNA 녹다운으로 Ddx54 가 43% 만 줄었다는 사실의 함의는?

🤔 Check yourself

miRNA 쪽(3 대 3) p값이 mRNA 쪽(4 대 3)보다 대체로 큰 이유로 알맞은 것은?