3강 / 20강

깊이가 다르다 — raw count 는 거짓말을 한다

WT 는 38만 개, KD 는 21만 개를 읽었다 · CPM 이라는 자

시퀀싱은 세포 안의 RNA 를 전부 세지 않습니다. 표본마다 기계가 읽어 낸 총 조각 수가 다르고, 그 총량은 실험 그날의 사정에 따라 두 배씩도 차이가 납니다.

이 자료가 딱 그렇습니다. 먼저 열별 총합을 봅시다.

고등학생raw count 는 거짓말을 한다

WT 표본은 38만 개, KD 표본은 21만 개 를 읽었다. 거의 두 배 차이다.

그러면 무슨 일이 생기나

어떤 miRNA 가 WT 에서 1,000개, KD 에서 700개 잡혔다고 하자. 줄어든 것인가?

	WT	KD
총 read	380,000	210,000
이 miRNA	1,000	700
비율	0.26%	0.33%

개수는 줄었는데 비율은 늘었다. 전혀 다른 결론이다.

깊이가 다르면 개수 비교는 아무 뜻이 없다

총합부터 봅니다. 이 한 줄을 건너뛰면 뒤가 전부 흔들립니다.

Python 브라우저에서 실행

import pandas as pd

mi = pd.read_csv("mirna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")

MIWT = ["WT_Ddx54_1", "WT_Ddx54_2", "WT_Ddx54_3"]
MIKD = ["Ddx54_KD_1", "Ddx54_KD_2", "Ddx54_KD_3"]

depth = mi.sum(axis=0)
for c in mi.columns:
    bar = "█" * int(depth[c] / 12000)
    print(f"{c:<14}{depth[c]:>9,}  {bar}")

print()
print(f"WT 평균 {depth[MIWT].mean():>10,.0f}")
print(f"KD 평균 {depth[MIKD].mean():>10,.0f}")
print(f"→ WT 쪽을 {depth[MIWT].mean() / depth[MIKD].mean():.2f} 배 더 깊게 읽었습니다.")

고등학생CPM 이라는 자

가장 단순한 정규화가 CPM(counts per million)이다.

CPM = (그 miRNA 의 count / 총 count) × 1,000,000

무엇을 하는 것인가

"총 read 를 100만 개 읽었다면 몇 개였을까" 로 환산하는 것이다. 표본마다 같은 분모 를 갖게 만든다.

장점	단점
단순 · 이해하기 쉬움	구성적 편향 에 취약
계산이 빠름	몇 종이 지배하면 나머지가 왜곡

CPM 은 출발점이지 정답이 아니다 — 그 한계를 4강에서 본다

CPM — 표본의 총합을 100만으로 맞추는 가장 단순한 자입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 정규화하지 않으면 어떤 일이 벌어지는지 직접 확인합니다.
import pandas as pd, numpy as np

mi = pd.read_csv("mirna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MIWT = ["WT_Ddx54_1", "WT_Ddx54_2", "WT_Ddx54_3"]
MIKD = ["Ddx54_KD_1", "Ddx54_KD_2", "Ddx54_KD_3"]
cpm = mi / mi.sum(axis=0) * 1e6

expressed = mi[mi.sum(axis=1) > 0]
raw_down_e = (expressed[MIKD].mean(axis=1) < expressed[MIWT].mean(axis=1)).sum()

print(f"raw count 로 'KD 에서 감소' 인 miRNA : {raw_down_e} / {len(expressed)}"
      f"  ({raw_down_e / len(expressed) * 100:.0f}%)")

# CPM = counts per million. 표본마다 총합을 100만으로 맞춘다 (위에서 이미 만들어 두었습니다).
cpm_e = cpm.loc[expressed.index]
cpm_down = (cpm_e[MIKD].mean(axis=1) < cpm_e[MIWT].mean(axis=1)).sum()

print(f"CPM 으로     'KD 에서 감소' 인 miRNA : {cpm_down} / {len(expressed)}"
      f"  ({cpm_down / len(expressed) * 100:.0f}%)")
print()
print("정규화 전에는 대부분이 '감소'로 보입니다. 그건 깊이 차이일 뿐입니다.")

CPM 이 하는 일, 그리고 하지 못하는 일

CPM 은 총합을 맞추는 것이 전부입니다. 이것만으로도 깊이 차이는 사라집니다. 하지만 CPM 에는 한계가 있습니다.

한 miRNA 가 전체의 20% 를 차지하고 있는데 그것이 KD 에서 늘어나면, 나머지 모든 miRNA 의 CPM 은 가만히 있어도 줄어듭니다.

총합이 100만으로 고정되어 있으니 누가 늘면 누구는 줄어야 하는 것이죠. 이것을 구성적 편향(compositional bias) 이라고 부릅니다. 실제 자료에서 이 문제가 얼마나 심각한지는 다음 4강에서 보게 됩니다 — 그리고 miRNA 자료는 mRNA 자료보다 이 문제가 훨씬 심합니다.

더 정교한 자를 쓰고 싶다면 TMM(edgeR) 이나 median-of-ratios(DESeq2) 를 씁니다. 이 강의에서는 CPM 으로 갑니다 — 계산이 눈에 보이고, 결론이 바뀌지 않기 때문입니다. 바뀌는지 아닌지는 18강에서 직접 확인합니다.

고등학생구성적 편향이란

CPM 의 분모는 총합 이다. 그러니 어느 한 miRNA 가 크게 변하면 나머지 전부 의 CPM 이 흔들린다.

숫자로 보자

	WT	KD
miR-A (지배종)	500,000	200,000
miR-B	1,000	1,000
총합	1,000,000	700,000
miR-B 의 CPM	1,000	1,429

miR-B 는 하나도 안 변했는데 CPM 이 43% 올랐다. miR-A 가 줄어서 생긴 일이다.

4강에서 이것이 현실이 된다

이 자료에서 두 종류가 전체의 35% 를 차지한다. 그 둘이 조금만 변해도 나머지 전부가 흔들린다.

비율 자료에서는 한 성분의 변화가 모든 성분에 번진다

miR-296-3p 는 raw 로 보면 '감소', CPM 으로 봐도 '감소' — 방향이 같은 경우입니다. miR-34b-5p 는 다릅니다.

Python 브라우저에서 실행

# 정규화 전후를 한 miRNA 에서 나란히 봅니다.
import pandas as pd, numpy as np

mi = pd.read_csv("mirna_counts.bin", sep="\t", index_col=0, compression="gzip")
MIWT = ["WT_Ddx54_1", "WT_Ddx54_2", "WT_Ddx54_3"]
MIKD = ["Ddx54_KD_1", "Ddx54_KD_2", "Ddx54_KD_3"]
cpm = mi / mi.sum(axis=0) * 1e6

for m in ["mmu-miR-34b-5p", "mmu-miR-296-3p"]:
    r = mi.loc[m]
    c = cpm.loc[m]
    print(f"── {m}")
    print(f"   raw  WT {r[MIWT].values}   KD {r[MIKD].values}")
    print(f"   CPM  WT {np.round(c[MIWT].values, 1)}   KD {np.round(c[MIKD].values, 1)}")
    print(f"   raw 로 보면 {r[MIKD].mean() / r[MIWT].mean():.2f} 배, "
          f"CPM 으로 보면 {c[MIKD].mean() / c[MIWT].mean():.2f} 배")
    print()

🎮 정규화 실험실

정규화 방식을 바꿔 가며 같은 miRNA 가 어떻게 달라 보이는지 확인하세요.

고등학생다른 정규화 방법들

방법	발상
CPM	총합으로 나눔
TMM (edgeR)	대부분의 유전자가 안 변한다고 가정 · 그 중앙값으로 보정
median-of-ratios (DESeq2)	비슷한 발상
분위수 정규화	분포 자체를 맞춤

TMM 계열의 발상

"대부분의 유전자는 조건 사이에 안 변할 것" 이라고 가정한다. 그러면 변하지 않은 다수 를 기준으로 삼아 표본 간 배율을 맞출 수 있다.

총합이 아니라 중앙값에 가까운 것들 을 쓰니 지배종의 영향을 덜 받는다.

18강에서 확인한다

"CPM 대신 다른 정규화를 쓰면 결론이 바뀌는가." 이것은 민감도 분석 이다. 결론이 방법에 의존하면 그 결론은 약하다.

정규화는 중립적 전처리가 아니라 가정을 담은 선택이다

🤔 확인 문제

KD 표본이 WT 보다 얕게 읽혔을 때 raw count 를 그대로 비교하면?

🤔 확인 문제

CPM 정규화가 해결하지 못하는 문제는?

🤔 확인 문제

이 자료에서 WT 평균 깊이는 KD 평균의 약 몇 배인가?