Lesson 16 of 20

중복 표시 — 없는 확신이 생긴다

제6장 「Picard로 중복 리드를 제거했다」

소설이 이 문제를 아주 정확하게 설명합니다.

"서른 겹으로 읽었다는 것은 서른 개의 독립적인 의견을 모았다는 뜻이다. 그래야 다수결이 의미가 있다. 그런데 시퀀싱 전에 DNA 양을 늘리려고 PCR로 복사를 한다. 복사본은 원본과 글자가 똑같다. 원본에 오류가 있었다면 복사본에도 그대로 있다."

없는 확신이 생긴다

깊이가 독립적인 의견의 수일 때만 다수결이 뜻을 갖습니다. 복사본은 의견이 아니라 메아리입니다.

중복은 비율을 바꾸지 않습니다. 바꾸는 것은 확신입니다. 그래서 조용히 지나가고, 결과는 자신만만합니다.

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# 중복이 만드는 가짜 확신 — 이항 검정으로
from scipy.stats import binomtest

err = 0.002        # 자리당 시퀀싱 오류율 (Q27쯤)
alt_true = 3       # 진짜로 서로 다른 조각에서 나온 변이 리드 3개
dp_true  = 30

r = binomtest(alt_true, dp_true, err, alternative="greater")
print(f"독립 리드 {dp_true}개 중 {alt_true}개가 변이  →  p = {r.pvalue:.2e}")

# 같은 조각이 4배로 복사되었다면 겉보기 숫자만 4배가 된다
f = 4
r2 = binomtest(alt_true * f, dp_true * f, err, alternative="greater")
print(f"중복 {f}배가 섞이면 겉보기 {alt_true*f}/{dp_true*f}  →  p = {r2.pvalue:.2e}")
print()
print(f"증거는 하나도 늘지 않았는데 p 값은 {r.pvalue/r2.pvalue:,.0f} 배 좋아 보입니다.")
print("문턱이 p < 1e-6 이라면, 없던 변이가 생깁니다.")

그래서 표적 패널이나 앰플리콘에서는 위치 기반 중복 표시를 쓰지 않습니다. 대신 UMI 를 씁니다.

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# 왜 '시작과 끝이 같으면' 중복인가 — 우연히 그럴 확률
G_locus = 20_000        # 교실 참조 20 kb
G_wgs   = 2_400_000_000

def collide(n_pairs, G, insert_sd=60):
    "같은 시작+끝을 우연히 공유할 짝의 기대 수 (대강)"
    distinct = G * (insert_sd * 6)      # 가능한 (시작, 인서트) 조합
    return n_pairs ** 2 / (2 * distinct)

print(f"{'참조 크기':>14}{'짝 수':>12}{'우연한 충돌 기대':>18}")
for name, G, n in [("교실 20 kb", G_locus, 6_000),
                   ("KIT 유전자좌", 100_000, 30_000),
                   ("전장유전체", G_wgs, 400_000_000)]:
    print(f"{name:>14}{n:>12,}{collide(n, G):>18,.0f}")
print()
print("좁은 참조에 리드를 많이 넣으면 '우연한 중복' 이 폭발합니다.")
print("교실 노트북에서 중복률이 실제보다 높게 나오는 이유입니다 — 겁내지 마세요.")

UMI — 위치 대신 꼬리표로 가른다

위치 기반

시작·끝이 같으면 중복. WGS 처럼 넓은 곳에서는 잘 듣는다. 좁은 곳에서는 진짜 다른 조각까지 지운다

UMI 기반

조각마다 무작위 꼬리표를 미리 붙여 둔다. 꼬리표가 같으면 확실히 같은 조각. 액체생검·저VAF 검사의 표준

UMI 는 중복 제거만 하는 것이 아닙니다. 같은 꼬리표를 가진 리드들의 다수결을 내면 시퀀싱 오류가 거의 사라집니다. 그래서 VAF 0.1% 를 볼 수 있습니다.

로지의 데이터에는 UMI 가 없습니다. 3,000 호주달러짜리 표준 WGS 였으니까요.

중복률을 읽는 법

중복률	대개 무슨 뜻
~5%	좋다. DNA 가 넉넉했고 PCR 사이클이 적었다
10~20%	흔한 범위. 문제 아니다
30% 이상	DNA 가 모자랐다. 같은 조각을 계속 다시 읽고 있다
50% 이상	더 깊이 읽어도 새 정보가 안 늘어난다. 라이브러리를 다시 만든다

중복률이 높으면 실질 깊이가 줄어듭니다. 60× 로 읽었는데 중복률 40% 면 쓸 수 있는 깊이는 36× 입니다.

그리고 이것은 돈 문제이기도 합니다 — 시퀀싱 비용의 40% 를 메아리에 쓴 것입니다.

곡선이 평평해지는 자리가 더 읽어도 소용없는 지점입니다. 시퀀싱을 더 살지 말지를 여기서 정합니다.

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# 라이브러리 복잡도 — 더 읽으면 새 정보가 얼마나 늘어나나
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt

def unique_fraction(reads, complexity):
    "쿠폰 수집가 문제 — 서로 다른 조각이 complexity 개 있을 때"
    return complexity * (1 - np.exp(-reads / complexity)) / reads

reads = np.linspace(1e6, 400e6, 300)
plt.figure(figsize=(7.2, 3.4))
for c, lab in [(1.5e9, "DNA 넉넉 (복잡도 1.5e9)"),
               (300e6, "보통 (3e8)"),
               (60e6,  "DNA 부족 (6e7)")]:
    plt.plot(reads / 1e6, 1 - unique_fraction(reads, c), lw=2, label=lab)
plt.xlabel("reads sequenced (millions)"); plt.ylabel("duplicate rate")
plt.legend(); plt.grid(alpha=.25); plt.tight_layout(); plt.show()

for c, lab in [(1.5e9, "넉넉"), (300e6, "보통"), (60e6, "부족")]:
    d = 1 - unique_fraction(300e6, c)
    print(f"{lab:<4} 라이브러리로 3억 리드를 읽으면 중복률 {d:>6.1%}"
          f"   실질 깊이 {60*(1-d):>5.1f}x")

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PCR 중복이 문제인 이유로 가장 정확한 것은?

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중복을 '지우지' 않고 FLAG 1024 로 '표시'만 하는 이유는?

Answer 정보를 버리지 않는 것이 원칙입니다. 중복률은 DNA 투입량과 PCR 사이클 수를 알려 주는 지표이고, 목적에 따라 중복을 포함해 보고 싶을 때도 있습니다. 변이 부르기는 -F 1024 로 알아서 걸러 냅니다.

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표적 패널이나 앰플리콘에서 위치 기반 중복 표시를 쓰지 않는 이유는?