11강 / 20강

퓨로마이신 3 µg/ml — 살아남은 것만 고른다

SI 「selected with 3 µg/ml puromycin」

렌티바이러스를 넣었다고 모든 세포에 들어가지는 않습니다. 들어간 것만 골라내야 해요. 그 방법이 선택 항생제입니다.

Successfully transduced cells were subsequently selected
with 3 µg/ml puromycin (Sigma-Aldrich)

고등학생퓨로마이신의 작동 원리

단계	내용
퓨로마이신	단백질 합성을 방해 — 리보솜에서 사슬이 끊김
내성 유전자 (pac)	퓨로마이신을 화학적으로 무력화
유전자가 들어간 세포	pac를 만들어 살아남음
안 들어간 세포	단백질을 못 만들어 죽음

퓨로마이신은 빠릅니다 — 2~3일이면 선별이 끝납니다.

퓨로마이신의 화학

퓨로마이신은 아미노아실-tRNA 를 닮은 아미노뉴클레오사이드입니다. 리보솜이 그걸 진짜 tRNA 로 착각하고 사슬 끝에 붙여요.

그런데 퓨로마이신에는 다음 아미노산을 이을 자리가 없습니다. 사슬이 거기서 끝나고 떨어져 나갑니다 — 번역이 통째로 멈춥니다.

유전자가 안 들어간 세포

번역이 멈춥니다. 죽어요.

들어간 세포

벡터에 딸려 온 PAC 효소가 퓨로마이신에 아세틸기를 붙여 무력화합니다. 삽니다.

고등학생3 µg/ml이라는 숫자

왜 하필 3일까요? 세포주마다 다릅니다. 미리 정해야 해요.

단계	하는 일
1	유전자를 안 넣은 세포에 여러 농도를 시험
2	3~5일 안에 전부 죽는 최소 농도를 찾음
3	그 농도를 선별에 씀

이것을 킬 커브(kill curve)라고 합니다 — 안 하면 선별이 헐겁거나 너무 세집니다.

농도가 낮으면	높으면
안 들어간 세포도 살아남음	들어간 세포도 죽음
혼합 집단	세포를 다 잃음

곡선의 모양은 <b>모의</b>입니다 — 논문에는 최종 농도만 적혀 있어요.

Python 브라우저에서 실행

# 죽음 곡선 — 어느 농도를 고를까
import numpy as np

농도 = [0, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10]      # µg/mL
논문값 = 3

def 생존(c, 저항):
    """저항=False 면 농도에 따라 죽는다"""
    if 저항: return 100.0
    return 100 * np.exp(-1.1 * c)

print(f"{'µg/mL':>7}{'안 들어간 세포':>14}{'들어간 세포':>12}   판정")
for c in 농도:
    a, b = 생존(c, False), 생존(c, True)
    if a > 5:   판정 = "약하다 — 안 들어간 것이 산다"
    elif a > 1: 판정 = "거의 다 죽는다"
    else:       판정 = "충분하다"
    표 = " ←논문" if c == 논문값 else ""
    print(f"{c:>7}{a:>13.1f}%{b:>11.0f}%   {판정}{표}")
print()
print("가장 낮으면서 안 들어간 세포를 다 죽이는 농도를 고른다.")

고등학생선별 후에 확인할 것

확인	방법
정말 유전자가 들어갔나	PCR·시퀀싱
단백질이 만들어지나	웨스턴블롯 — 9강
얼마나 균일한가	단일 클론을 분리할지 결정
세포가 정상인가	형태·증식 속도

항생제를 이겨 냈다는 것이 원하는 유전자가 제대로 작동한다는 뜻은 아닙니다.

내성 유전자만 발현되고 본 유전자는 조용한 경우가 있어요. 그래서 반드시 따로 확인해야 합니다.

🤔 확인 문제

퓨로마이신이 세포를 죽이는 화학적 방식은?