13강 / 20강

NanoDrop — 빛이 얼마나 줄었나로 양을 잰다

SI 「quantity was assessed using a NanoDrop」

RNA 를 뽑았으면 얼마나 뽑혔는지 재야 합니다. NanoDrop 은 시료 1~2 µL 에 빛을 쏘고 얼마나 줄었는지 봅니다.

A = ε · c · ℓ

Beer-Lambert 법칙입니다. 흡광도 A 는 농도 c 에 비례해요. 그래서 A 를 재면 c 를 압니다.

고등학생빛이 얼마나 줄었나로 양을 잰다

NanoDrop은 아주 적은 양(1~2 µl)으로 핵산 농도를 잽니다. 원리는 단순해요.

단계	내용
1	시료에 빛을 통과시킴
2	통과한 빛의 세기를 잼
3	얼마나 줄었는지로 농도를 계산

비어–람베르트 법칙: 흡광도 = 흡광계수 × 농도 × 경로 길이

핵산의 염기는 260 nm 자외선을 잘 흡수합니다. 그래서 260에서 재요.

왜 하필 260 과 280 인가

260 nm — 핵산

염기의 고리 구조(공액 π 계)가 이 파장을 흡수합니다. A·T·G·C 가 모두요.

280 nm — 단백질

Trp · Tyr 의 방향족 고리가 흡수합니다 (/chem 10강). 그래서 단백질마다 흡수량이 달라요.

고등학생260/280과 260/230

NanoDrop이 두 가지 비율을 같이 알려 줍니다. 이것이 순도를 나타내요.

비율	무엇을 보나	좋은 값
260/280	단백질 오염 (단백질은 280을 흡수)	DNA 1.8 · RNA 2.0
260/230	염·페놀·구아니딘 오염	2.0~2.2

260/230이 낮으면 추출 시약이 남아 있다는 뜻입니다 — 다음 반응을 방해합니다.

12강의 에탄올 세척이 부족했거나, 카오트로프가 남았을 때 이 값이 떨어집니다.

환산계수 40·50 과 순도 기준 1.8·2.0 은 <b>표준값</b>입니다 — 논문 값이 아니에요.

Python 브라우저에서 실행

# A260 에서 농도와 순도를 뽑는다 (환산계수는 표준값)
환산 = {"dsDNA": 50.0, "ssDNA": 33.0, "RNA": 40.0}   # 1 A260 = ? ng/µL

측정 = [
    ("좋은 RNA",     0.42, 0.21, 0.19),
    ("단백질 오염",   0.42, 0.30, 0.19),
    ("구아니딘 잔류", 0.42, 0.21, 0.45),
]
print(f"{'시료':14}{'A260':>7}{'A280':>7}{'A230':>7}"
      f"{'ng/µL':>9}{'260/280':>9}{'260/230':>9}   판정")
for 이름, a260, a280, a230 in 측정:
    농도 = a260 * 환산["RNA"]
    r80, r30 = a260 / a280, a260 / a230
    if r80 < 1.9:   판정 = "단백질·페놀 오염"
    elif r30 < 1.8:판정 = "염·구아니딘 잔류"
    else:           판정 = "쓸 만하다"
    print(f"{이름:14}{a260:>7.2f}{a280:>7.2f}{a230:>7.2f}"
          f"{농도:>9.1f}{r80:>9.2f}{r30:>9.2f}   {판정}")
print()
print("RNA 는 260/280 이 2.0 근처, DNA 는 1.8 근처가 기준이다 (교과서 값).")

고등학생흡광도가 못 하는 것

구분 못 하는 것	왜
DNA와 RNA	둘 다 260을 흡수
온전한 RNA와 잘린 RNA	염기 수는 같음
유리 뉴클레오타이드	염기 하나도 260을 흡수

"양은 많은데 쓸 수 없는" 경우가 있습니다 — 다 잘린 RNA도 농도는 높게 나옵니다.

그래서 RNA 품질은 별도로 봅니다 — Bioanalyzer 같은 장비로 RIN(RNA 완전성 지수)을 재요. 시퀀싱을 할 거라면 필수입니다.

A260 이 2 를 넘으면 <b>희석해서 다시</b> 재는 것이 원칙입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 흡광도가 너무 높으면 못 믿는다 — 선형 구간
import numpy as np, matplotlib.pyplot as plt

농도 = np.linspace(0, 4000, 300)          # ng/µL
이상 = 농도 / 40.0                        # A260, 완벽하게 비례할 때
실제 = 이상 / (1 + 이상 / 12.0)           # 높은 쪽에서 휜다

fig, ax = plt.subplots(figsize=(7, 3.8))
ax.plot(농도, 이상, "--", label="이상 (Beer-Lambert)")
ax.plot(농도, 실제, label="실제 측정")
ax.axhline(2.0, color="gray", lw=1, ls=":")
ax.text(50, 2.15, "A260 = 2 — 이 위는 희석해서 다시", fontsize=8)
ax.set_xlabel("concentration (ng/uL)"); ax.set_ylabel("A260")
ax.legend(); ax.grid(alpha=.3)
plt.show()

고등학생형광 정량과의 차이

	흡광 (NanoDrop)	형광 (Qubit 등)
원리	260 nm 흡수	핵산에 붙는 염료의 형광
특이성	낮음 — 다 흡수	높음 — dsDNA만 등
감도	낮음	높음
순도 정보	줌	안 줌

둘을 같이 씁니다 — NanoDrop으로 순도를, 형광으로 정확한 농도를.

🤔 확인 문제

RNA 시료의 A260/A280 이 1.6 으로 나왔습니다. 무슨 뜻일까요?

🤔 확인 문제

NanoDrop 으로 알 수 없는 것은?